纳米抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提出了一种纳米抗体。该抗体包括：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。该纳米抗体是特异性靶向PCSK9的抗体，能够结合天然构象的PCSK9，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。

Nano-antibodies and their preparation methods

The invention provides a nano-antibody. The antibody includes: (1) having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1; or (2) having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, and at least 99% identity compared with (1). The nano-antibody is a specific antibody targeting PCSK9 and can bind to PCSK9 with natural conformation. The nano-antibody has high water solubility, high tolerance, high stability, high antigen binding, low immunogenicity, strong tissue penetration and high expression.

【技术实现步骤摘要】
纳米抗体及其制备方法
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及纳米抗体及其制备方法和应用，更具体地，本专利技术涉及纳米抗体、分离的核酸、核酸构建体、表达载体、宿主细胞、噬菌体、药物组合物、纳米抗体在制备药物中的用途以及制备纳米抗体的方法。
技术介绍
目前市面上用于降低胆固醇的药物主要有他汀类(statins)、胆固醇吸收抑制剂、普罗布考等。尽管他汀类药物心血管疾病治疗上表现出色，但随着其广泛使用，可能产生的弊端也渐渐被发现。首先，强化他汀治疗患者仍有较高心血管事件残余风险，在2年内发生的风险达22.4％；其次，有大量患者无法耐受他汀类药物，尤其是家族性高胆固醇血症患者，即使接受最大剂量的最有效的他汀类药物治疗，仍然不能达到降低LDL-C浓度的目的；最重要的是，他汀类药物存在多种副作用，如引起患者血糖异常、肌肉毒性、记忆和认知障碍等，副作用的发生率高达20％，严重的副作用会导致横纹肌溶解和急性肾功能衰竭，相当一部分患者因不能忍受副作用带来的肌肉疼痛而终止了治疗。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9,PCSK9)，枯草蛋白酶亚家族的一种新的前蛋白转化酶，是常染色体显性家族性高胆固醇血症的重要影响因子之一。研究发现，PCSK9除了能影响血浆胆固醇水平，调节神经细胞的凋亡，还与炎症反应有一定的相关性。目前对于PCSK9的研究主要集中在对肝脏脂质代谢的调节功能。前期的研究显示，PCSK9可通过促进肝细胞的低密度脂蛋白受体(low-densitylipoproteinreceptor,LDL-R)的降解，调节肝脏脂质代谢，进而影响血浆中低密度脂蛋白胆固醇(low-densitylipoproteincholesterol,LDL-C)的水平。但PCSK9存在两种突变类型，功能获得型突变和功能缺失型突变。族群试验显示，若干PCSK9“获得功能”的突变常发生于体染色体显性高胆固醇血症的个体，而PCSK9“失去功能”的突变则与血浆胆固醇减少有，PCSK9功能缺失型突变个体患冠心病的风险明显降低。2005年，Hobbs等在DallasHeartStudy上报道了携带PCSK9无义突变基因的个体中LDL-C水平会比一般人低28％；在2006，Hobbs等又发表PCSK9基因突变对冠心病的作用，该结果基于一项动脉粥样硬化风险调查，他们对9523个白人和3363个非洲裔美国人进行了长达15年的跟踪观察，发现缺失1个或2个PCSK9功能基因的人群的冠心病的发病率显著低于普通人群。CopenhagenHeartStudy发现PCSK9基因的功能性缺失会使LDL-C水平下降11-15％，冠心病患病率下降6-46％。Zimbabwe等报道了PCSK9的缺失突变可使非洲女性的LDL-C水平下降27％。PCSK9抑制剂提供了一种全新的治疗模式来对抗LDL-C，被视为他汀类之后降脂领域取得的最大进步。PCSK9抑制剂的出现，为那些服用他汀类药物时出现严重副作用的患者，及他汀类药物治疗无法达到LDL-C目标水平的患者，如遗传性高胆固醇血症患者带来了福音。PCSK9抑制剂除了能阻止LDL-R回收，还可以抑制NF-κB通道，从而减少血栓、炎症、血管内皮细胞激活等急性冠状动脉综合症的风险。目前PCSK9抑制剂这个领域潜在的研究项目有抑制蛋白抗体、siRNA、反意寡核苷酸以及小分子抑制剂等。单克隆抗体药物因具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，是目前PCSK9抑制剂研究的主要领域。在动物水平的研究显示，加入中和抗PCSK9的抗体之后，小鼠肝脏中的LDL-R表达水平显著上升，血液中LDL-C浓度下降30％。对灵长类动物，PCSK9单克隆抗体也表现出显著的效果，LDL-C水平的下降效果可维持数周以上。到目前为止，还没有发现抗PCSK9蛋白单抗类药物有比较明显的毒副作用，只有报道称出现过局部注射反应、腹泻和头疼等较轻微的副作用。赛诺菲的Praluent(Alirocumab)和安进的Repatha(evolocumab)是目前全球市场唯二获批的人源化的PCSK9抗体。因此，开发我国国产化PCSK9抗体抑制剂，满足我国国民对于抗体药物的迫切需求，具有深远而积极的意义。
技术实现思路
本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：现有技术对于PCSK9纳米抗体的开发集中在鼠源传统抗体，传统抗体无论是大量表达，还是进行抗体人源化都比较困难，耗时长，花费高，并且有效抗体获得率低，严重限制了PCSK9抗体抑制剂的开发，特别是国内抗体药物刚刚处于起步阶段，完全不能满足CVD患者的需求。本申请的专利技术人采用骆驼免疫与噬菌体展示技术相互结合，开发出了靶向PCSK9的高亲和纳米抗体，为治疗因PCSK9异常而导致的疾病奠定了良好的基础，为满足我国国民对于PCSK9抗体药物的迫切需求，具有深远而积极的意义。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种纳米抗体。根据本专利技术的实施例，所述抗体包括：(1)具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。ESGGGSVQAGGSLRLSCTVSGYTYSSNCMGWFRQAPGKEHEGVASIYIGGGSTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAVGCQGLVDFGYWDQGTQVTVSS(SEQIDNO:1)。根据本专利技术实施例的纳米抗体是特异性靶向PCSK9的单价抗体，能够结合天然构象的PCSK9，并且所述纳米抗体具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种分离的核酸。根据本专利技术的实施例，所述核酸为：编码前面所述抗体的核酸或其互补序列。根据本专利技术实施例的核酸特异性编码前面所述的抗体，所述抗体能够特异性靶向PCSK9，结合天然构象的PCSK9，具有高水溶性、高耐性、高稳定性，高抗原结合性、低免疫原性、较强的组织穿透力以及高表达性。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种核酸构建体。根据本专利技术的实施例，所述核酸构建体包含：编码序列，所述编码序列为前面所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。根据本专利技术实施例的构建体能在宿主细胞高效表达，进而大量产生前面所述纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种表达载体。根据本专利技术的实施例，所述载体包含前面所述的核酸构建体。根据本专利技术实施例的构建体在特定的转染条件下可高效导入宿主细胞，整合或不整合入宿主细胞基因组，进而高效表达前面所述的纳米抗体，有利于前面所述纳米抗体的大规模生产，易于普及和应用。在本专利技术的第五方面，本专利技术提出了一种噬菌体。根据本专利技术的实施例，所述噬菌体包含前面所述的核酸、前面所述的核酸构建体、表达载体或表达前面所述的纳米抗体。根据本专利技术实施例的噬菌体可将前面所述的纳米抗体在噬菌体表面融合表达出来，所述噬菌体具有与PCSK9高特异性的亲和活性。在专利技术的第六方面，本专利技术提出了一种宿主细胞。根据本专利技术的实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述抗体：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。

【技术特征摘要】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述抗体：(1)具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列；或(2)与(1)相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性。2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述抗体具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列，所述抗体的框架区1具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区2具有SEQIDNO：3所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区3具有SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，所述抗体的框架区4具有SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区1具有SEQIDNO：6所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区2具有SEQIDNO：7所示的氨基酸序列，所述抗体的互补决定区3具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸为：编码权利要求1～2任一项所述抗体的核酸或其互补序列，优选地，所述核酸具有SEQIDNO：9所示核苷酸序列。4.一种核酸构建体，其特征在于，包含：编码序列，所述编码序列为权利要求3所述的核酸，以及可选的控制序列，所述控制序列与所述编码序列可操作地连接。5.一种表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4所述的核酸构建体。6.一种噬菌体，其特征在于，所述噬菌体包含权利要求3所述的核酸、权利要求4所述的核酸构建体、权利要求5所述的表达载体或表达权利要求1～2任一项所述的纳米抗体。7.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞携带权利要求4所述的核酸构建体或权利要求5所述的表达载体，可选地，所述宿主细胞是通过转染或者转化所述核酸构建体或表达载体获得，任选地，所述宿主细胞为原核细胞；任选地，所述原核细胞为HB2151。8.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1～2任一项所述的纳米抗体；以及药学上可接受的佐剂。9.权利要求1～2任一项所述的纳米抗体在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗PCSK9相关性疾病，任选地，所述PCSK9相关性疾病为脑血管疾病、高胆固...

【专利技术属性】
技术研发人员：王媚娘，杨乃波，曹丽霞，黄谧，刘楚新，张婷婷，李新洋，李波，侯勇，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：广东,44