治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体及其制备方法，首先体外表达纯化了人Plk1蛋白，以重组Plk1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合；通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞；用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得5株治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。相比现有技术，本发明专利技术的制备工艺简单、易行，试剂易得，一次性可提取5株针对癌症治疗靶点：人Plk1蛋白的鼠单克隆抗体，它们通过调控蛋白的活性调控细胞周期；可以通过进一步的抗体人源化改造使其成为具有治疗功能的抗癌药物前体。

Therapeutic monoclonal antibody against human Plk1 protein and its preparation method

The invention provides a therapeutic monoclonal antibody against human Plk1 protein and its preparation method. Firstly, human Plk1 protein is expressed and purified in vitro, and Balb/c mice are immunized with recombinant Plk1 protein as immunogen. Splenocytes of immunized mice are fused with SP2/0 cells of mouse myeloma; hybridoma cells secreting specific McAb are screened by indirect ELISA method; and hybridoma cell lines are used to induce mouse production. Five therapeutic monoclonal antibodies against human Plk1 protein were obtained from raw ascites and purified by protein G affinity chromatography. Compared with the existing technology, the preparation process of the present invention is simple, feasible, reagents are easy to obtain, and five monoclonal antibodies against human Plk1 protein can be extracted at one time, which can regulate cell cycle by regulating the activity of the protein, and can be humanized to become a precursor of anticancer drugs with therapeutic function by further modification of the antibody.

【技术实现步骤摘要】
治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体及其制备方法
本专利技术属于生物
，尤其是治疗性人Plk1蛋白单克隆抗体及其制备方法。本专利技术涉及5株特异性针对癌症治疗靶点的人Plk1蛋白的鼠单克隆抗体，它们通过调控蛋白的活性调控细胞周期，可以通过进一步的抗体人源化改造使其成为具有治疗功能的抗癌药物前体。
技术介绍
Polo样激酶1(Polo-likekinase1，Plk1)是细胞周期中一种重要的调控蛋白，研究表明，Plk1和肿瘤发生发展有着密切关系，使其成为了肿瘤治疗的最具潜力的靶点之一。Plk1从其被发现开始就一直是肿瘤生物学领域的一个研究热点。无论是科研机构还是制药公司都竞相角逐，对其进行了广泛研究，希望以其为突破口深入研究肿瘤的发生机制以及找到合适的药物或治疗方案。目前对Plk1的研究广泛，Plk1在细胞周期进程中对多种事件发挥重要调控作用,与肿瘤的发生发展密切相关。在肿瘤的治疗中,以Plk1为治疗靶点已表现出良好的应用前景。抗体药物是一种由抗体物质组成的药物，从目前全球已经上市的抗体药物的治疗领域分布来看，主要用于肿瘤和自身免疫病的治疗。抗体的制备技术主要经历了三代：第一代是利用抗原免疫动物后获得抗体，成为多克隆抗体；第二代是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体；第三代是利用基因工程技术制备而来称为基因工程抗体。现阶段针对Plk1的药物主要以合成的小分子药物为主，包括ATP竞争性抑制剂，非ATP竞争性抑制剂和其他抑制剂，在药物开发的过程中需要克服其造成的细胞毒性和脱靶效应。而抗体针对相应抗原具有高特异性和高亲和力的特性，使得其在疾病的诊断和治疗中显示出其他类型药物无可比拟的优势。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术首先体外表达纯化了人Plk1蛋白，以重组Plk1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合；通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞；用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白G亲和层析法纯化抗体，最终获得5株治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。本专利技术的技术方案如下：治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：S1，利用PCR技术体外扩增Plk1基因，Plk1基因的核酸序列为SEQIDNO.1所示；S2，Plk1基因的表达和纯化：将Plk1基因连接进入pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导后收集菌体；高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex-200柱子进行再次精细纯化，收集Plk1蛋白作为抗原备用，Plk1蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示；S3，小鼠的免疫：用纯化的Plk1蛋白作为抗原，对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只进行三次免疫，每次免疫间隔两周，第三次免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60ug/只，进行加强免疫一次；S4，骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合：分别收集免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞，DMEM培养基洗涤3次后，调整脾细胞数与SP2/0细胞数之比为1∶10，50％PEG1500作用1～2min后，加入含有HAT的完全培养基稀释，接种于96孔培养板，37℃，5％CO2培养；S5，阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化：经间接ELISA方法连续检测两次都为阳性的细胞孔，按有限稀释法进行亚克隆；如检出细胞孔有特异性抗Plk1蛋白抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的杂交瘤细胞孔，继续同法再克隆至少2次，克隆后阳性孔的杂交瘤细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，可冻存杂交瘤细胞；S6，单克隆抗体的生产：对已经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体；S7，单克隆抗体的纯化：腹水用20mMPBSpH7.4稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrapproteinG亲和层析进行纯化，获得治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。作为该制备方法的优选方案，S3的免疫方案具体为：第一阶段，小鼠选取：选取6-8周龄，健康活跃小鼠3只，编号；第二阶段，抗原乳化：每只小鼠60ug，抗原+1×PBS总体积为350ul，与等体积福氏佐剂混合乳化3500次，200次/min，获得每0.2ml含60ug抗原的乳化液；第三阶段，第一次免疫：用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第四阶段，第二次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第五阶段，第三次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第六阶段，测效价：间隔10±1天后取血检测进行Elisa检测。作为该制备方法的优选方案，S4的亚克隆方案具体为：克隆前一天制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到每毫升5、10、50个细胞；将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板中100μL/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和5个细胞；培养第4天半量换液一次，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；在克隆后第10-14天，细胞长满约1/4-1/2孔底时，进行全量换液，次日进行间接ELISA检测。作为该制备方法的优选方案，S6的诱生小鼠腹水生产单克隆抗体方案具体为：取10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只，7天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105-1×106/只，7-10天后抽取小鼠腹水。作为该制备方法的优选方案，获得的治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体，采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定人Plk1蛋白单克隆抗体的Ig亚型；通过间接ELISA测定人Plk1蛋白单克隆抗体的效价；利用WesternBlotting鉴定人Plk1蛋白单克隆抗体的特性。作为该制备方法的优选方案，间接ELISA测定人Plk1蛋白单克隆抗体的效价的方法是：Plk1蛋白以100ng/孔包被，将单抗按1：10000、1：20000、1：40000、1：80000、1：160000、1：320000、1：640000、1：1280000、1：2560000、1：5120000、1：10240000、1：20480000稀释，通过间接ELISA法测定其A450nm值；以与免疫蛋白靶抗原发生反应的单克隆抗体的最大稀释度即为其效价，测定孔读数与阴性对照值之比大于2.1为阳性。作为该制备方法的优选方案，利用WesternBlotting鉴定人Plk1蛋白单克隆抗体的特性的方法是：将Plk1蛋白经蛋白质电泳后转移仪PVDF膜上，加入含3％BSA后4℃封闭过夜，分别加入5株Plk1单克隆抗体室温孵育2h，以HRP标记的羊抗鼠IgG的抗体为二抗，室温孵育1h，用ECL显色。本专利技术还保护如上所述的制备方法制备获得的5株治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。本专利技术首先体外表达纯化了人Plk1蛋白，以重组Plk1蛋白为免疫原，免疫Balb/c小鼠，取免疫小鼠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，利用PCR技术体外扩增Plk1基因，Plk1基因的核酸序列为SEQ ID NO.1所示；S2，Plk1基因的表达和纯化：将Plk1基因连接进入pET‑28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导后收集菌体；高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex‑200柱子进行再次精细纯化，收集Plk1蛋白作为抗原备用，Plk1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；S3，小鼠的免疫：用纯化的Plk1蛋白作为抗原，对6‑8周龄的雌性BALB/c小鼠3只进行三次免疫，每次免疫间隔两周，第三次免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60ug/只，进行加强免疫一次；S4，骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合：分别收集免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞，DMEM培养基洗涤3次后，调整脾细胞数与SP2/0细胞数之比为1∶10，50％PEG1500作用1～2min后，加入含有HAT的完全培养基稀释，接种于96孔培养板，37℃，5％CO2培养；S5，阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化：经间接ELISA方法连续检测两次都为阳性的细胞孔，按有限稀释法进行亚克隆；如检出细胞孔有特异性抗Plk1蛋白抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的杂交瘤细胞孔，继续同法再克隆至少2次，克隆后阳性孔的杂交瘤细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，可冻存杂交瘤细胞；S6，单克隆抗体的生产：对已经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体；S7，单克隆抗体的纯化：腹水用20mM PBS pH7.4稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrap protein G亲和层析进行纯化，获得治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。...

【技术特征摘要】
1.治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，利用PCR技术体外扩增Plk1基因，Plk1基因的核酸序列为SEQIDNO.1所示；S2，Plk1基因的表达和纯化：将Plk1基因连接进入pET-28a载体中，并将质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导后收集菌体；高压破碎菌体，离心后收集上清，利用Ni柱亲和层析纯化蛋白；纯化后的蛋白利用Superdex-200柱子进行再次精细纯化，收集Plk1蛋白作为抗原备用，Plk1蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示；S3，小鼠的免疫：用纯化的Plk1蛋白作为抗原，对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只进行三次免疫，每次免疫间隔两周，第三次免疫后10天，尾部采血，并用间接ELISA检测小鼠产生的抗体滴度；在融合前的第3天尾静脉最后一次注射重组抗原，剂量为60ug/只，进行加强免疫一次；S4，骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合：分别收集免疫小鼠脾细胞和SP2/0细胞，DMEM培养基洗涤3次后，调整脾细胞数与SP2/0细胞数之比为1∶10，50％PEG1500作用1～2min后，加入含有HAT的完全培养基稀释，接种于96孔培养板，37℃，5％CO2培养；S5，阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化：经间接ELISA方法连续检测两次都为阳性的细胞孔，按有限稀释法进行亚克隆；如检出细胞孔有特异性抗Plk1蛋白抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的杂交瘤细胞孔，继续同法再克隆至少2次，克隆后阳性孔的杂交瘤细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，可冻存杂交瘤细胞；S6，单克隆抗体的生产：对已经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体；S7，单克隆抗体的纯化：腹水用20mMPBSpH7.4稀释3倍以上，离心取上清，经HiTrapproteinG亲和层析进行纯化，获得治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的治疗性的人Plk1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S3的免疫方案具体为：第一阶段，小鼠选取：选取6-8周龄，健康活跃小鼠3只，编号；第二阶段，抗原乳化：每只小鼠60ug，抗原+1×PBS总体积为350ul，与等体积福氏佐剂混合乳化3500次，200次/min，获得每0.2ml含60ug抗原的乳化液；第三阶段，第一次免疫：用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第四阶段，第二次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液，并记录注射时间和部位；第五阶段，第三次免疫：间隔两周，用2ml注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘丽，邬玉兰，汪涛，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：广东,44