一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及细胞免疫技术领域，且公开了一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用，步骤一：BCMA单域抗体文库构建，步骤二：BCMA特异性纳米抗体序列筛选，步骤三：嵌合抗原受体T细胞制备；其主要应用在肿瘤治疗药物中，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病，所述血液相关的肿瘤疾病为主要包括各类白血病和恶性淋巴瘤。该基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用，制备出的纳米抗体表达序列更短，节省有限的慢病毒载体空间，基于该抗体构建的嵌合抗原受体T细胞特异性更好，肿瘤杀伤能力更强。

Construction of chimeric antigen receptor based on BMCA nano-antibody sequence and its application

The invention relates to the field of cellular immunity technology, and discloses a construction method and application of chimeric antigen receptor based on BMCA nano-antibody sequence. Step 1: construction of BCMA single domain antibody library, step 2: screening of BCMA specific nano-antibody sequence, step 3: preparation of chimeric antigen receptor T cells, which is mainly used in cancer therapy drugs, and the tumors are blood-related. The blood-related tumors mainly include various types of leukemia and malignant lymphoma. The construction method of chimeric antigen receptor based on BMCA nano-antibody sequence and its application have shortened the expression sequence of the prepared nano-antibody, saved the limited space of lentivirus vector, and constructed chimeric antigen receptor T cells based on the antibody have better specificity and stronger killing ability to tumors.

【技术实现步骤摘要】
一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用
本专利技术涉及细胞免疫
，具体为一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用。
技术介绍
近年来，嵌合抗原受体(chimericangitenreceptor，CAR)修饰T细胞为基础的肿瘤过继免疫治疗取得重大进展。修饰后的T细胞不仅具有靶向肿瘤细胞的杀伤能力，且可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受的状态。CAR通过不断地改进，目前已经发展到了第四代。第一代CAR主要由识别肿瘤相关抗原的scFv和ITAM(通常为CD3ζ)构成，但是由于仅有CD3ζ活化信号，T细胞不能充分增值，且活化的T细胞在体内存活时间短。第二代CAR在一代CAR的基础上加入一个共刺激分子如CD28、CD134、CD137等等，增强了T细胞激活、增殖、体内维持时间，从而提高抗肿瘤的效应。第三代CAR在二代CAR的基础上再引入一个以上的共刺激分子。第四代CAR(TRUCKS，Tcellsredirectedforuniversalcytokinekilling)主要通过引入IL-12，IL-23，IL-27等细胞因子，招集固有免疫细胞-巨嗜细胞等杀伤TAA阴性的肿瘤细胞。嵌合抗原受体T细胞是通过基因修饰的手段，将一个人工合成的CAR分子(ChimericAntigenReceptor)表达在T细胞膜上，使T细胞以抗原抗体结合的方式识别并杀伤肿瘤细胞。CAR分子包括胞外的抗原结合区域、铰链区、跨膜区和胞内的信号段。比较常见的的CAR抗原结合区域由人或者鼠的重链和轻链的可变区组成的scFv组成。与ScFV相比，来自羊驼的纳米抗体序列VHH表达框更短，而且特异性更高。我们通过免疫羊驼经过筛选获得的BCMA纳米抗体序列亲和力更高，基于该序列构建的嵌合抗原受体在体外表现出优异的肿瘤杀伤活力。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用，具备制备出的纳米抗体表达序列更短，节省有限的慢病毒载体空间，基于该抗体构建的嵌合抗原受体T细胞特异性更好，肿瘤杀伤能力更强优点，解决了常见的的CAR抗原结合区域由人或者鼠的重链和轻链的可变区组成的scFv表达序列更长和肿瘤杀伤能力低的问题。(二)技术方案为实现上述的目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法，具体步骤如下：步骤一：BCMA单域抗体文库构建通过大肠杆菌表达BCMA蛋白的胞外区域(1-54氨基酸)对羊驼进行定期免疫，免疫期间通过取血采样，评估免疫反应效果，免疫结束后，取外周血通过淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，提取淋巴细胞RNA并反转录成cDNA，通过引物将VHH序列扩增出来后插入噬菌体展示载体，并通过电转化将携带有单域抗体基因片段的产物转入感受态大肠杆菌，从而获得单域抗体免疫文库。步骤二：BCMA特异性纳米抗体序列筛选利用噬菌体展示技术将单域抗体分子展示于噬菌体表面，进而筛选出抗原特异性的单域抗体，将BCMA蛋白包被到96孔板中，通过Elisa实验3-5轮筛选，BCMA特异性的噬菌体逐步得到富集。步骤三：嵌合抗原受体T细胞制备将胞外分泌信号序列、BCMA纳米抗体序列、铰链区、跨膜区和胞内的信号段串联起来，克隆到慢病毒载体，与包装质粒共转染到293T细胞，纯化浓缩慢病毒后感染T细胞，即可获得针对BCMA的嵌合抗原受体T细胞。优选的，所述大肠杆菌表达BCMA蛋白的过程为：选取大肠杆菌BL21,在37摄氏度，IPTG诱导下，在LB液体培养基中超量表达BCMA蛋白的胞外区域(1-54氨基酸)，然后将其注入羊驼的体内进行定期免疫。优选的，所述取血采用具体过程为：采血前，先在羊驼颈部找准静脉后剪毛，用碘酒、酒精进行局部消毒，然后用容积5ml的一次性真空采血管在羊驼的静脉采血5.0ml,然后迅速拔出针头,并轻轻转动真空采血管,使血液与抗凝剂充分混和,立即置于装有冰块的冰壶内,并在20h内将冰壶带回实验室。优选的，所述Elisa实验具体过程为：将单域抗体和BCMA蛋白在噬菌体酶对底物的高效催化作用相结合起来。优选的，所述纯化浓缩慢病毒具体步骤为：一纯化：取6个Ultra-clearSW28离心管，用70％乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟，每个Ultra-clearSW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液，取一支10ml的移液管，吸取12ml20％的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4ml，另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理，用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g，按次序将所有6个离心管放入BeckmanSW28超速离心转头中，倒掉上清，在管底应当有可见的沉淀，每管中加入100ml不含钙和镁的PBS洗下沉淀，将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子，用200μl移液器轻柔吹打使沉淀重悬，将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中，集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃；二浓缩法：5XPEG8000+NaCl配制称取NaCl8.766g；PEG800050g溶解在200mlMilli-Q纯水中；121摄氏度30min湿热灭绝30min；保存在4℃；使用0.45μm滤头过滤慢病毒上清液；每30ml过滤后的病毒初始液，加入5XPEG-8000+NaCl母液7.5ml；每20～30min混合一次，共进行3-5次；4摄氏度放置过夜；吸弃上清，静置管子1～2分钟，吸走残余液体，加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；集中后的病毒悬液分装成50μl每份，保存在成品管中，用碎干冰速冻后储存在-80℃。一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建的应用，其主要应用在肿瘤治疗药物中，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病，所述血液相关的肿瘤疾病为主要包括各类白血病和恶性淋巴瘤。(三)有益效果与现有技术相比，本专利技术提供了一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用，具备以下有益效果：1、该基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法及其应用，制备出的纳米抗体表达序列更短，节省有限的慢病毒载体空间，基于该抗体构建的嵌合抗原受体T细胞特异性更好，肿瘤杀伤能力更强。具体实施方式下面将结合本专利技术实的施例中，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法，具体步骤如下：步骤一：BCMA单域抗体文库构建通过大肠杆菌表达BCMA蛋白的胞外区域(1-54氨基酸)对羊驼进行定期免疫，免疫期间通过取血采样，评估免疫反应效果，免疫结束后，取外周血通过淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，提取淋巴细胞RNA并反转录成cDNA，通过引物将VHH序列扩增出来后插入噬菌体展示载体，并通过电转化将携带有单域抗体基因片段的产物转入感受态大肠杆菌，从而获得单域抗体免疫文库。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：步骤一：BCMA单域抗体文库构建通过大肠杆菌表达BCMA蛋白的胞外区域(1‑54氨基酸)对羊驼进行定期免疫，免疫期间通过取血采样，评估免疫反应效果，免疫结束后，取外周血通过淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，提取淋巴细胞RNA并反转录成cDNA，通过引物将VHH序列扩增出来后插入噬菌体展示载体，并通过电转化将携带有单域抗体基因片段的产物转入感受态大肠杆菌，从而获得单域抗体免疫文库。步骤二：BCMA特异性纳米抗体序列筛选利用噬菌体展示技术将单域抗体分子展示于噬菌体表面，进而筛选出抗原特异性的单域抗体，将BCMA蛋白包被到96孔板中，通过Elisa实验3‑5轮筛选，BCMA特异性的噬菌体逐步得到富集。步骤三：嵌合抗原受体T细胞制备将胞外分泌信号序列、BCMA纳米抗体序列、铰链区、跨膜区和胞内的信号段串联起来，克隆到慢病毒载体，与包装质粒共转染到293T细胞，纯化浓缩慢病毒后感染T细胞，即可获得针对BCMA的嵌合抗原受体T细胞。

【技术特征摘要】
1.一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：步骤一：BCMA单域抗体文库构建通过大肠杆菌表达BCMA蛋白的胞外区域(1-54氨基酸)对羊驼进行定期免疫，免疫期间通过取血采样，评估免疫反应效果，免疫结束后，取外周血通过淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，提取淋巴细胞RNA并反转录成cDNA，通过引物将VHH序列扩增出来后插入噬菌体展示载体，并通过电转化将携带有单域抗体基因片段的产物转入感受态大肠杆菌，从而获得单域抗体免疫文库。步骤二：BCMA特异性纳米抗体序列筛选利用噬菌体展示技术将单域抗体分子展示于噬菌体表面，进而筛选出抗原特异性的单域抗体，将BCMA蛋白包被到96孔板中，通过Elisa实验3-5轮筛选，BCMA特异性的噬菌体逐步得到富集。步骤三：嵌合抗原受体T细胞制备将胞外分泌信号序列、BCMA纳米抗体序列、铰链区、跨膜区和胞内的信号段串联起来，克隆到慢病毒载体，与包装质粒共转染到293T细胞，纯化浓缩慢病毒后感染T细胞，即可获得针对BCMA的嵌合抗原受体T细胞。2.根据权利要求1所述的一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌表达BCMA蛋白的过程为：选取大肠杆菌BL21,在37摄氏度，IPTG诱导下，在LB液体培养基中超量表达BCMA蛋白的胞外区域(1-54氨基酸)，然后将其注入羊驼的体内进行定期免疫。3.根据权利要求1所述的一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法，其特征在于：所述取血采用具体过程为：采血前，先在羊驼颈部找准静脉后剪毛，用碘酒、酒精进行局部消毒，然后用容积5ml的一次性真空采血管在羊驼的静脉采血5.0ml,然后迅速拔出针头,并轻轻转动真空采血管,使血液与抗凝剂充分混和,立即置于装有冰块的冰壶内,并在20h内将冰壶带回实验室。4.根据权利要求1所述的一种基于BMCA纳米抗体序列的嵌合抗原受体的构建方法，其特征在于：所述Elisa实验具体过程为：将单域...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅志超，王雨，罗新高，
申请(专利权)人：深圳市南科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44