本发明专利技术属于肿瘤分子诊断和靶向治疗领域，具体是通过生物信息学分析TCGA数据找到在头颈癌中显著高表达的lncRNA RP11‑499F3.2，临床样本验证RP11‑499F3.2在头颈鳞癌中的表达水平显著高于癌旁组织，且与头颈鳞癌患者临床预后密切相关。功能学实验发现高表达RP11‑499F3.2能促进头颈鳞癌细胞体外增殖、迁移和侵袭。同时，本发明专利技术还发现RP11‑499F3.2能促进头颈鳞癌细胞对西妥昔单抗的耐药。本发明专利技术公开的lncRNA RP11‑499F3.2有助于揭示头颈癌新的发病机制，为头颈癌的预后监测提供新的肿瘤标志物，同时为头颈癌的临床治疗提供新的思路。
Application of a long-chain non-coding RP11-499F3.2 in clinical detection and reversal of cetuximab resistance in head and neck cancer
The present invention belongs to the field of molecular diagnosis and targeted therapy of tumors. Specifically, through bioinformatics analysis of TCGA data, the highly expressed lncRNA RP11 499F3.2 in head and neck cancer is found. Clinical samples verify that the expression level of RP11 499F3.2 in head and neck squamous cell cancer is significantly higher than that in adjacent tissues, and is closely related to the clinical prognosis of patients with head and neck squamous cell cancer. Functional experiments showed that high expression of RP11 499F3.2 could promote the proliferation, migration and invasion of head and neck squamous cell carcinoma cells in vitro. At the same time, the invention also found that RP11 499F3.2 could promote cetuximab resistance of head and neck squamous cell carcinoma cells. The lncRNA RP11 499F3.2 disclosed by the invention helps to reveal the new pathogenesis of head and neck cancer, provides a new tumor marker for the prognosis monitoring of head and neck cancer, and provides a new idea for the clinical treatment of head and neck cancer.
【技术实现步骤摘要】
一种长链非编码RP11－499F3.2在头颈癌临床检测及逆转肿瘤西妥昔单抗耐药治疗中的应用
本专利技术属于肿瘤诊断和分子靶向治疗领域，更具体地说，涉及一种长链非编码RNARP11-499F3.2在头颈癌的临床检测及逆转肿瘤西妥昔单抗耐药治疗中的应用。
技术介绍
头颈癌是肿瘤疾病中排名第七的恶性肿瘤类型，约占人体全身恶性肿瘤疾病的7％，其中多于90％的头颈癌属于头颈鳞癌(Headandnecksquamouscellcarcinoma，HNSCC)。每年超过50万患者被确诊为头颈鳞癌，中国新发病例数约占其中的1/5，每年死亡病例数约5.6万例。一般意义上头颈鳞癌分为口腔癌、鼻咽癌、口咽癌及喉癌等。同时，由于约四分之一的头颈鳞癌患者与体内感染乳头瘤病毒(HPV)相关(尤其是口咽癌患者)，头颈鳞癌也可分为HPV阴性及阳性肿瘤。吸烟与嗜酒等不良生活习惯被普遍认为是头颈鳞癌发生的诱因。同时由于患者诊断意识较差，患者体内远端转移或复发症状(Recurrentormetastatic，R/M)较为普遍等原因，头颈鳞癌疾病的临床早期诊断及综合治疗仍受到极大限制，头颈鳞癌患者的平均生存期仅为5年。长链非编码RNA(Longnon-codingRNA，lncRNA)是目前研究肿瘤疾病机制的重点，其定义是非编码RNA分子中核苷酸(nt)长度大于200个，且缺少完整开放阅读框(Openreadingframe，ORF)的RNA分子。lncRNA具有较高的组织与细胞特异性，大量的lncRNA被报道在肿瘤疾病中具有差异表达谱，被认为是潜在的原癌基因及肿瘤抑制基因，并有望作为临床诊断分期及治疗的理想靶标。目前，lncRNA参与肿瘤疾病发生发展已被普遍认同，但其具体分子机制仍需大量研究作为实验依据。因此，本专利技术通过分析头颈鳞癌的lncRNA差异表达谱，研究相关lncRNA的功能机制，希望为发现头颈鳞癌的生物标志物提供依据。手术切除、化疗及放疗等传统方式是头颈鳞癌患者常用的临床治疗方法，但由于头颈部器官位置特殊，该类治疗较易造成患者器官功能性损伤，影响生存质量。同时对于被诊断为晚期或出现远端转移、局部复发症状的头颈鳞癌患者，传统治疗的治疗效果往往不尽人意。随着恶性肿瘤疾病的分子病理学研究逐渐开展，诸多肿瘤类型的治疗效果已被证明与信号通路调控及靶基因突变有关，头颈鳞癌靶向治疗也开启了临床治疗新思路。跨膜糖蛋白表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)可通过激活下游通路(如PI3K及ERK-1/2等)进而调控肿瘤细胞增殖、侵袭及耐药性产生等生命活动，是头颈鳞癌中重要的靶标分子，90％的头颈鳞癌患者过表达EGFR。西妥昔单抗(Cetuximab，商品名Erbitux)于2011年11月7日成为首个FDA批准用于头颈鳞癌的靶向治疗药物，据报道，仅有10％-20％的头颈鳞癌患者在西妥昔单抗长期治疗中取得完全缓解。但目前，其耐药性产生机制仍不明确，本专利技术通过对头颈鳞癌西妥昔单抗耐药相关lncRNA的作用机制进行研究，希望为临床治疗提供参考。
技术实现思路
1.专利技术目的针对上述问题，本专利技术的目的是发现一种与头颈癌相关的长链非编码RNARP11-499F3.2。该lncRP11-499F3.2与头颈鳞癌临床诊断及预后密切相关，能促进头颈鳞癌细胞体外增殖及转移，可作为头颈鳞癌潜在的生物标志物。针对其设计的锁核甘酸能提高西妥昔单抗耐药的敏感性。2.技术方案为了实现上述目的，技术方案如下：本专利技术公开了一种长链非编码RNARP11-499F3.2，是由专利技术人综合分析癌症基因图谱(TCGA)数据库中头颈癌和正常癌旁组织的lncRNA表达谱芯片数据发现的一个显著高表达在头颈癌组织中的lncRNA。其位于人类染色体15：81，660，482-81，871，125反义链，DNA序列如SEQIDNO.1所示。用于头颈癌的临床检测方法为实时定量PCR，所述的方法包括：从患有头颈癌的对象获得测试样品；确定所述测试样品中包括长链非编码RNARP11-499F3.2的表达水平；和分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于提供对象的预后。更进一步地，所述的测试样品是液氮保存的肿瘤组织和血清。更进一步地，用于检测生物标志物表达水平的试剂是实时定量PCR检测试剂盒。用于实时定量PCR的检测引物序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。用于评估lncRP11-499F3.2对头颈癌细胞功能的影响，具体的实验步骤如下：采用lncRP11-499F3.2过表达和沉默慢病毒分别感染SCC4细胞，筛选出稳转细胞，然后分别做细胞增殖、迁移侵袭和划痕实验检测本专利技术还公开了一种建立稳定西妥昔单抗耐药细胞系的方法：采用浓度梯度筛选法建立SCC4/CTX耐药细胞株。为了探究lncRP11-499F3.2在西妥昔单抗耐药中的作用，我们通过设计锁核甘酸特异性调控RP11-499F3.2的表达。具体地，这一特异锁核甘酸序列见SEQIDNO.4。更进一步地，以非特异性序列NC的序列作为阴性对照，序列见SEQIDNO.5，分别转染SCC4/CTX细胞株，通过检测耐药细胞体外增殖及转移能力变化，考察lncRP11-499F3.2对西妥昔单抗耐药细胞的敏感性变化。同时，我们考察特异性锁核甘酸对头颈鳞癌体内西妥昔单抗耐药的影响。具体地说，通过体内多次传代建立头颈鳞癌西妥昔单抗耐药PDX模型，瘤内注射给予一定剂量的lncRP11-499F3.2的锁核甘酸，监测肿瘤体积变化。3.有益效果(1)本专利技术发现lncRP11-499F3.2在头颈鳞癌中显著高表达，且与预后密切相关，可作为头颈鳞癌潜在的生物标志物；(2)本专利技术发现lncRP11-499F3.2在头颈癌细胞中的表达水平显著高于口腔上皮细胞，lncRP11-499F3.2缺失表达后能够明显抑制头颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成，提示其对肿瘤生长和转移的重要性，为头颈癌靶向治疗提供参考；(3)本专利技术通过体外建立西妥昔耐药细胞株，体内建立西妥昔耐药PDX模型，发现下调lncRP11-499F3.2表达有助于恢复头颈癌细胞对西妥昔单抗的敏感性，进一步证明lncRP11-499F3.2是头颈鳞癌西妥昔单抗耐药表型产生的关键lncRNA；(4)本专利技术还尝试特异性干扰RP11-499F3.2在西妥昔单抗其它适应症，包括结肠癌、食管癌、非小细胞肺癌耐药细胞模型中的作用，为西妥昔单抗的临床治疗拓展方向；(5)本专利技术设计的实验科学合理、可行有效，对长链非编码RNARP11-499F3.2的研究深入系统；基于以上发现，lncRP11-499F3.2表达水平可作为一个新的生物标志物辅助头颈癌的诊断和恶性程度的预测，特别是逆转耐药头颈癌患者对西妥昔单抗治疗的反应性，提高治疗效果，具有良好的转化医学前景。附图说明图1为头颈癌组织和癌旁组织中差异表达的LncRNA芯片聚类图，数据来自TCGA数据库；图2为lncRP11-499F3.2表达水平与HNSCC患者总生存率的关系，数据来自TCGA数据库；图3为lncRP11-499F3.2在46对头颈癌组织和癌旁组织中的表达量比较，数据来自TCGA数据库；图4为lncRP11-4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种长链非编码RP11‑499F3.2在头颈癌临床检测及逆转肿瘤西妥昔单抗耐药治疗中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种长链非编码RP11-499F3.2在头颈癌临床检测及逆转肿瘤西妥昔单抗耐药治疗中的应用。2.根据权利要求1所述的一种长链非编码RP11-499F3.2，其特征在于所述长链非编码RNA序列如序列表中SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述头颈癌为包括口腔鳞癌、鼻咽癌在内的头颈鳞状细胞癌。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的用于头颈癌的临床检测试剂为实时定量PCR检测试剂。5.根据权利要求1所述的逆转肿瘤西妥昔单抗耐药治疗中的应用，其特征在于，通过合成特异性锁核甘酸(LockedNucleicAcid，LNA)调控lncRP11-499F3.2的表达。6.根据权利要求1所述的逆转肿瘤西妥昔单抗耐药...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐寒梅，武和明，李梦玮，
申请(专利权)人：中国药科大学，南京医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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