一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，包括能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针。本发明专利技术还公开了NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒在制备预测结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。本发明专利技术的NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒能准确检测出NTRK3基因启动子区甲基化程度；基于NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，本发明专利技术从基因甲基化角度提供一种评估结直肠癌患者预后的方法，经大样本临床试验，该评估方法能有效预测结直肠癌患者预后。

A Kit for Detecting Methylation Degree in Promoter Region of NTRK3 Gene and Its Application

The invention discloses a detection kit for the methylation degree of NTRK3 gene promoter region, including primer pairs capable of amplifying the methylated DNA chain in the promoter region of NTRK3 gene and probes for the promoter region of NTRK3 gene. The invention also discloses the application of the NTRK3 gene promoter methylation detection kit in the preparation of a kit for predicting the prognosis of patients with colorectal cancer. The NTRK3 gene promoter methylation detection kit of the invention can accurately detect the methylation degree of the NTRK3 gene promoter region; Based on the NTRK3 gene promoter region methylation degree detection kit, the invention provides a method for evaluating the prognosis of patients with colorectal cancer from the perspective of gene methylation. After large sample clinical trials, the evaluation method can effectively predict patients with colorectal cancer. Prognosis.

【技术实现步骤摘要】
一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及基因检测
，尤其是一种NTRK3基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及其应用。
技术介绍
结直肠癌是世界十大恶性肿瘤之一，也是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前，临床上尚缺乏评估结直肠癌患者预后的方法。因此，建立预测患者预后的技术方法，对结直肠癌的诊疗有重大意义。结直肠癌的发生和发展主要是基因突变和表观遗传修饰导致的，而表观遗传修饰最主要的方式是DNA甲基化，它不改变DNA的一级结构，却在细胞的发育、基因表达及基因组的稳定性中起着重要的作用，在结直肠癌的诊断、治疗和预后评估方面有非常重要的意义。专利技术人通过甲基化芯片、MSP、焦磷酸测序等方法发现和验证了结直肠癌组织中NTRK3启动子区异常甲基化，并在mRNA和蛋白质层面上证实了NTRK3启动子区异常甲基化会抑制NTRK3的表达。研究表明，NTRK3基因是一个抑癌基因，它可通过MAPK信号通路诱导凋亡。因此，NTRK3启动子区异常甲基化可能会阻碍NTRK3抑癌作用的发挥，进而促进结直肠癌的发生发展。进一步研究表明，NTRK3启动子区异常甲基化提示结直肠癌患者预后不良。然而，目前市场上缺乏能准确地检测NTRK3启动子区异常甲基化程度的试剂盒和方法。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能准确地检测NTRK3启动子区异常甲基化程度的试剂盒以及检测方法，并建立一种预测结直肠癌患者预后的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，所述试剂盒包括能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针。作为上述方案的进一步优化，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.1和2所示。需要说明的是，引物对依据双重荧光定量甲基化特异性PCR设计，相比单一PCR效率更高。作为上述方案的进一步优化，所述探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示。应当说明的是，本专利技术的引物对和探针的碱基序列包括但不限于如SEQIDNO.1～3所示的碱基序列，还应包括其它能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物以及能与NTRK3基因启动子区稳定结合的探针。优选地，针对NTRK3的探针的5’端连接有荧光基团FAM，3’端连接有淬灭基团MGBNFQ。作为上述方案的进一步优化，所述试剂盒还包括针对内参基因的引物组和探针。作为上述方案的进一步优化，所述内参基因为Alu-c4。作为上述方案的进一步优化，所述引物组的碱基序列如SEQIDNO.4和5所示，所述针对Alu-c4的探针的碱基序列如SEQIDNO.6所示。优选地，针对Alu-c4的探针的5’端连接有荧光基团VIC，3’端连接有淬灭基团MGBNFQ。作为上述方案的进一步优化，所述试剂盒还包括亚硫酸氢盐。由此，亚硫酸氢盐处理基因组DNA后，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。作为本专利技术的另一个方面，本专利技术提供了上述的检测试剂盒在制备预测结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。作为本专利技术的又一个方面，本专利技术提供了上述的检测试剂盒与血清CA19-9的检测试剂的联合使用在制备预测结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。本申请的专利技术人经多次实验发现，NTRK3基因启动子区甲基化状态联合术前血清CA19-9水平能更详细、准确地评估结直肠癌患者预后。综上所述，本专利技术的有益效果为：本专利技术的NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒能准确检测出NTRK3基因启动子区甲基化程度；基于NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，本专利技术从基因甲基化角度提供一种评估结直肠癌患者预后的方法，经大样本临床试验，该评估方法能有效预测结直肠癌患者预后。附图说明图1为结直肠癌患者的生存时间与特异生存率的统计结果图；图2是NTRK3基因启动子区甲基化和血清CA19-9水平对结直肠癌患者的特异生存率影响的统计结果图。具体实施方式目前临床上尚缺乏评估结直肠癌患者预后的方法，本专利技术提供一种能准确检测NTRK3基因启动子区甲基化程度的试剂盒，该试剂盒能用于评估结直肠癌预后，该试剂盒能特异检测出NTRK3基因启动子区甲基化程度；同时，通过大样本病例数据分析，发现了NTRK3基因启动子区甲基化状态与结直肠癌患者生存率的相关性。因此，本专利技术通过检测NTRK3基因启动子区甲基化程度来预测结直肠癌患者的预后，结果是可靠的。在一些实施例中，本专利技术提供了与结直肠癌预后相关的检测试剂盒，其中包括用于扩增NTRK3基因启动子区甲基化DNA的引物(SEQIDNO.1和2)以及相应的探针(SEQIDNO.3)；在一些实施例中，本专利技术提供了检测NTRK3基因启动子区甲基化程度的试剂在制备评估结直肠癌患者预后的试剂盒中的应用。为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。如无特别说明，本申请的实验方法均为常规方法。实施例1本专利技术的NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒的一种实施例，包括亚硫酸氢盐和能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针，引物对的碱基序列如SEQIDNO.1和2所示，探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示；试剂盒还包括针对内参基因Alu-c4的引物组和探针，引物组的碱基序列如SEQIDNO.4和5所示，针对Alu-c4的探针的碱基序列如SEQIDNO.6所示，如下表1所示。表1引物对和探针序列本实施例的试剂盒检测待测样本的反应体系如下表2所示。表2反应体系本实施例的试剂盒检测待测样本的反应程序如下表3所示。表3反应程序本实施例的试剂盒包含上述表1的双重荧光定量甲基化特异性PCR引物对、探针；原装引物为粉末，使用时需配置成表2中浓度，现配现用。原装探针浓度为100uM，使用时需配置成表2中浓度，现配现用。本实施例的试剂盒的检测原理为：DNA甲基化程度可通过荧光定量甲基化特异性PCR来检测，首先用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。扩增过程在荧光定量PCR仪中完成，PCR仪输出Ct值，采用相对定量法，计算△Ct＝Ct目的基因–Ct内参基因，△△Ct＝△Ct样品-△Ct标准品，PMR＝2-△△CtX100，PMR可表示甲基化程度。本试剂盒以双重荧光定量PCR仪为检测载体来设计试剂配比和剂量，双重荧光定量PCR比单一荧光定量PCR具有更高效率。本实施例的试剂盒按照上述表2的反应体系和表3的反应程序，可以特异地检测出NTRK3基因启动子区甲基化程度，根据发现的NTRK3基因启动子区甲基化状态和结直肠癌特异生存期的相关性，准确地预测结直肠癌患者预后。实施例2本专利技术的NTRK3基因启动子区甲基化程度检测方法的一种实施例，采用实施例1的试剂盒，包括如下步骤：S1：从肿瘤组织中提取DNA；S2：对步骤S1中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；S3：按照实施例1中反应体系，把引物对、探针、试剂与S2中得到的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针。

【技术特征摘要】
1.一种NTRK3基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括能扩增出NTRK3基因启动子区甲基化DNA链的引物对以及针对NTRK3基因启动子区的探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQIDNO.1和2所示。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的碱基序列如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对内参基因的引物组和探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈子健，黄增鸿，骆衍新，向军，禹汇川，彭绍勇，李英杰，白亮亮，康蔓妮，王小琳，唐冠楠，
申请(专利权)人：中山大学附属第六医院，中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44