一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法技术

本发明专利技术属于多肽制备方法技术领域，特别涉及一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽GLP‑1(7‑37)的方法。其主要步骤包括构建重组利拉鲁肽中间体工程菌，通过培养和诱导大肠杆菌表达GLP‑1(7‑37)融合蛋白，再经过变性、复性、酶切和分离纯化得到中间体多肽GLP‑1(7‑37)。通过改变前导肽序列，表达方式变为胞内不溶性包涵体表达，表达量显著增加；洗涤后的包涵体采用碱性溶解，无需使用大量的变性剂，以蛋白浓度为5‑40g/L的高浓度加入包涵体溶解缓冲液，变复性时间不超过1h，溶解后可以立即进行肠激酶酶切；减少复性工序，缩小酶切体系，降低化学试剂成本，有利于工业化放大；采用离子交换分离纯化，分离度高。本发明专利技术制备的利拉鲁肽中间体多肽GLP‑1(7‑37)达到92％以上，收率大于87％。

A Fusion Protein and a Method for Preparing Liraglutide Intermediate Peptide

The invention belongs to the technical field of polypeptide preparation method, in particular to a fusion protein and a method for preparing liraglutide intermediate polypeptide GLP 1 (7 37). The main steps include the construction of recombinant liraglutide intermediate engineering bacteria, the expression of GLP 1 (7 37) fusion protein in E. coli by culture and induction, and the denaturation, renaturation, enzyme digestion and purification of the intermediate polypeptide GLP 1 (7 37). After washing, the inclusion bodies were dissolved in alkaline solution without using a large amount of denaturant. The inclusion bodies were dissolved in a high concentration of 5 40g/L protein and added into the inclusion body solution buffer. The renaturation time was not more than 1 hour, and the enterokinase digestion could be carried out immediately after dissolution. Reducing the enzyme digestion system and reducing the cost of chemical reagents is conducive to industrial enlargement. Ion exchange separation and purification are adopted with high separation degree. The liraglutide intermediate polypeptide GLP 1 (7 37) prepared by the invention reaches 92% and the yield is over 87%.

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法
本专利技术涉及基因工程及多肽制备方法
，具体涉及一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法。
技术介绍
糖尿病是由于遗传和环境因素相互作用，引起胰岛素绝对或相对分泌不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低，引起蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，其中以高血糖为主要标志。临床典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状。而近年来，随着生活水平的提高，饮食结构变化，大多数人动少坐多等因素，导致全球糖尿病发病率增长迅速。其中，1型糖尿病患者占10％，2型糖尿病患者占90％。利拉鲁肽(Liraglutide)是一种通过基因重组技术生产的胰高血糖素样肽(GLP-1)类似物，与天然人GLP-1(7-37)具有97％的序列同源性，与天然的GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特性更适用于每天1次的给药方案。皮下注射给药后，其主要通过如下机理延长作用时间：一是通过自联作用使吸收减慢，二是与白蛋白结合，三是对DPP-Ⅳ和NEP具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。在2型糖尿病患者中，单次给予利拉鲁肽可以观察到胰岛素分泌率以葡萄糖浓度依赖的模式增加。目前国内利拉鲁肽完全依赖进口，价格昂贵，因此迫切需要提供一种利拉鲁肽的制备方法，为广大糖尿病患者带来福音。利拉鲁肽作为胰高血糖素肽(GLP-1)类似物的代表药物之一，在美国和欧洲地区，它作为2型糖尿病患者经二甲双胍单药或其他抗糖尿病口服药物治疗失败后的二三线药物使用。2013年版中国2型糖尿病防治指南中规定将胰高血糖素(GLP-1)类似物作为三线治疗药物使用。利拉鲁肽的多个临床试验研究已经证明联合不同的口服降糖药可以有效控制血糖，并能够使患者减轻体重、减少收缩压及改善胰岛β细胞功能。利拉鲁肽结构式如下：NH2-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-(N-ε-(N-α-Palmitoyl-L-γ-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH由以上结构式可知：利拉鲁肽分子式为C172H265N43O51，分子量为3751.20，是在天然GLP-1分子结构上将第34位的赖氨酸Lys改为精氨酸Arg，并在26位增加了1条16碳棕榈脂肪酸(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)))侧链而得到的衍生物。利拉鲁肽最早由诺和诺德公司开发研制，通过基因重组技术，利用酵母生产获得。现有技术中中间体多肽GLP-1(7-37)的合成方法主要采用化学合成，如专利CN104045706B公开了使用多种大量有机溶剂，对于环境不友好，且步骤繁琐不利于大规模工业放大；工艺杂质多；总收率仅18％。另外涉及生物制备方法的专利CN104745597A中公开了表达方式为胞内可溶性表达，表达量较低，不利于工业化放大。专利CN104592381A中公开了包涵体溶解耗时过长，体积过大，使用大量的尿素；包涵体需要长时间复性并且复性蛋白浓度0.2g/L，复性所需体积过大，不利于工业放大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种融合蛋白和制备利拉鲁肽中间体多肽GLP-1(7-37)的方法，通过基因重组技术，利用大肠杆菌发酵诱导表达获得LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)融合蛋白，其中LeadingPeptide作为融合蛋白的前导肽，有助于融合蛋白的高水平表达和利拉鲁肽中间体多肽的复性；DDDDK表示天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸，作为肠激酶识别位点，用于切除融合蛋白的LeadingPeptide；GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素样肽的7位-37位氨基酸序列片段(第34位氨基酸由Lys突变为Arg)，是目的蛋白序列。上述融合蛋白经过溶解、变复性、酶切、分离等操作获得高收率和高纯度的多肽GLP-1(7-37)，解决了现有技术中存在的杂质多、收率低、使用大量有机试剂对环境不友好，胞内可溶性表达导致表达量低，包涵体溶解和变复性时间长，蛋白浓度低导致变复性体积过大，不适合大规模生产，并限制了产能提升的问题。为了实现上述目的，本专利技术提供如下的技术方案，一种用于合成利拉鲁肽中间体多肽GLP-1(7-37)的融合蛋白LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)，包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，采用如下前导肽：MATHAVSVLKGDGX1VQGIINFEQHESNGX2VKVWGSIHGLX3EGLHGFHVHKFVNQHLCGX4HLVALX5LV，其中X1,X2：为P和Y中的任何一个氨基酸；X3,X4和X5：为S,T和Y中的任何一个氨基酸。本专利技术还提供了一种重组表达载体，包含编码所述融合蛋白的编码基因。作为优选，所述重组表达载体，通过将所述编码基因克隆插入质粒载体pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-39b(+)中获得重组表达载体pET-24a(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)、pET-28a(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)、pET-29a(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)或pET-39b(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)。本专利技术还提供了一种包含所述重组表达载体的重组工程菌，采用所述的重组表达载体转入到大肠杆菌中得到，所述大肠杆菌包括JM109(DE3)、HMS174(DE3)、BL21(DE3)和Rostta2(DE3)等。本专利技术还提供了一种所述重组工程菌在重组利拉鲁肽中间体GLP-1(7-37)表达方面的应用。本专利技术还提供了一种利用所述编码基因合成利拉鲁肽中间体多肽GLP-1(7-37)的方法，具体包括以下步骤：1)、合成编码上述融合蛋白LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)的编码基因；2)、将编码基因连接到表达载体中；3)、将带有编码基因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组工程菌；4)、利用抗性平板筛选含有目的基因质粒的重组工程菌；5)、重组工程菌发酵，诱导胞内不溶性包涵体形式的融合蛋白的表达，表达量高；所述融合蛋白包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；6)、将收集后的菌体进行细胞高压均质破碎，收集包涵体、然后将包涵体经过洗涤和变复性；7)、酶切转化、分离纯化获得中间体多肽GLP-1(7-37)。作为本专利技术的进一步改进，所述的步骤2)中编码基因与表达载体的连接方式为：通过HindIII/XhoI、HindIII/NcoI、XhoI/EagI或者SacI/SalI等酶切位点插入到质粒载体pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)或pET-39b(+)相应酶切位点中。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤5)中重组工程菌进行发酵培养，诱导表达所用的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为Leading Peptide‑DDDDK‑GLP‑1(7‑37)，包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，在利拉鲁肽中间体制备中，采用如下前导肽：MATHAVSVLKGDGX1VQGIINFEQHESNGX2VKVWGSIHGLX3EGLHGFHVHKFVNQHLCGX4HLVALX5LV，X1,X2：为P和Y中的任何一个氨基酸；X3,X4和X5：为S,T和Y中的任何一个氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)，包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，在利拉鲁肽中间体制备中，采用如下前导肽：MATHAVSVLKGDGX1VQGIINFEQHESNGX2VKVWGSIHGLX3EGLHGFHVHKFVNQHLCGX4HLVALX5LV，X1,X2：为P和Y中的任何一个氨基酸；X3,X4和X5：为S,T和Y中的任何一个氨基酸。2.一种重组表达载体，其特征在于：含有编码权利要求1所述融合蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：通过将所述的编码基因克隆进入质粒载体pET-24a(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)或者pET-39b(+)中获得重组表达载体pET-24a(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)、pET-28a(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)、pET-29a(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)或pET-39b(+)-LeadingPeptide-DDDDK-GLP-1(7-37)。4.一种包含权利要求3所述的重组表达载体的重组工程菌，其特征在于：采用所述的重组表达载体转入到大肠杆菌JM109(DE3)、HMS174(DE3)、BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)中任意一种得到。5.一种权利要求4所述的重组工程菌在重组利拉鲁肽中间体GLP-1(7-37)表达方面的应用。6.一种利拉鲁肽中间体GLP-1(7-37...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘尚书，汤传根，李宬，刘晓锐，崔怀言，陈松，张昊宁，
申请(专利权)人：美药星南京制药有限公司，南京汉欣医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32