一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法技术

本发明专利技术提供了一种新型门冬胰岛素原的结构设计和门冬胰岛素制备方法。其中主要步骤包括设计门冬胰岛素原的序列，构建重组门冬胰岛素工程菌，通过工程菌诱导以包涵体形式表达门冬胰岛素融合蛋白，再经过变性、复性、酶切和分离纯化得到成熟的门冬胰岛素原料药。发明专利技术通过改变重组前导肽和C‑肽序列，避免使用溴化氢切割这种危险而繁琐的步骤；缩短C‑肽为1个氨基酸，减少酶切转化的质量损失。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法
本专利技术涉及多肽制备方法
，具体涉及一种新型的短门冬胰岛素原的结构设计和由其制备门冬胰岛素的方法。
技术介绍
胰岛素是一种调节动物体内葡萄糖代谢的激素。这种激素是由A链和B链2条肽链组成，A链有21个氨基酸和B链有30个氨基酸，共51个氨基酸。其中A7(Cys)-B7(Cys)，A20(Cys)-B19(Cys)4个半胱氨酸形成2个二硫键连接A链和B链。在A链中有A6(Cys)和A11(Cys)形成链内二硫键。糖尿病的特点是由于胰岛素分泌缺乏和/或增加的肝葡萄糖生产而导致的血糖水平升高。胰岛素是针对糖尿病患者的药物。胰岛素类似物发展的总体目标是模拟生理性的胰岛素分泌，从而改善1型和2型糖尿病患者的血糖控制(BergerM,Acomment.DiabetesResClinPract.6:S25–S31,1989.和NosekL等人,Diabetes,ObesityandMetabolism,15:77-83,2013.)。近期的胰岛素类似物(天然胰岛素的类似物)包括由基因工程或生物化学反应在天然胰岛素分子上额外附加氨基酸残基或替换氨基酸残基，或对其他功能组的修饰。这些修饰通过改变胰岛素分子的药理学、药代动力学和药效动力学特性，改变了生物药效率的速度，如甘精胰岛素、门冬胰岛素、赖脯胰岛素等。门冬胰岛素(美国专利US5618913，US5547930，US5834422)是一种快速作用的胰岛素类似物，在皮下注射后迅速分离和吸收，显示了单体的稳定性。门冬胰岛素，天然胰岛素的B28脯氨酸被天冬氨酸代替，增强电荷排斥，从而进一步阻止六聚体形成。因此，与正常的人胰岛素相比，门冬胰岛素的作用更迅速，效力持续时间更短。此外，门冬胰岛素与血浆蛋白的结合程度较低，它比普通人胰岛素更快的从血液中清除(NosekL等人,Diabetes,ObesityandMetabolism,15:77-83,2013；和SanliogluAD等人,Clinicalutilityofinsulinandinsulinanalogs.Islets5(2):67-78,2013.)。在哺乳动物中，胰岛素是在胰腺β-细胞内进行合成、加工和储存的。人胰岛素基因位于11号染色体的短臂上。胰岛素的信使RNA被翻译成109个氨基酸的单链多肽前体，称为前胰岛素原。前胰岛素原含有一种23个氨基酸的信号肽。在转移到粗糙型内质网期间，将前胰岛素原的信号肽去除，形成胰岛素原。胰岛素原由3个部分组成：氨基末端B链(30个氨基酸)，羟基末端A链(23个氨基酸)和被称为C-肽(35个氨基酸)的中间连接肽。在内质网内，胰岛素原折叠成天然的构象，形成3个二硫键。正确折叠的胰岛素原被转运到高尔基体并被包装成分泌颗粒，在高尔基体内胰岛素原经历了蛋白酶水解，产生由A链和B链2条肽链组成的有活性的胰岛素。A链和B链，由2个二硫键连接，同时释放C-肽成为一个自由的肽片段。C-肽有限制性的酶切位点位于2个基本序列(赖氨酸64，精氨酸，65和精氨酸31，精氨酸32)，在C-肽被酶切去除后，通过羧肽酶去除精氨酸31残基。当细胞受到刺激时，成熟的胰岛素，连同C-肽一起被分泌到血液循环中，以调节血糖(SteinerDF,In.PancreaticBetaCellinHealthandDisease.Pp31-49,2008.)。胰岛素原的生物活性仅为胰岛素的10％。人胰岛素是重组DNA技术生产的第一个蛋白类药物。1978年，人胰岛素在实验室中首次成功表达；1982年，重组人胰岛素被批准作为治疗药物。重组人胰岛素的前体蛋白是由遗传修饰的生物合成，并通过蛋白水解切割生成有活性的胰岛素。几乎所有公开出售的胰岛素类似物都是用基因工程技术从人胰岛素基因中改良出来的，并在大肠杆菌或酵母中生产。重组人胰岛素的合成方法是用以下方法完成的。例如，使用大肠杆菌表达系统的方法，要么在细胞质中表达一个大的融合蛋白(Rich,D.H.等人，PierceChemicalCompany,Rockford.Pp.721-728，1981；和Frank,B.H.等人，PierceChemicalCompany,Rockford.Pp.729-738,1981.)，要么使用一个信号肽，使分泌物进入到胞质空间(Chan,S.J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78(9):5401-5404,1981.)中。同时也报道了一种利用酵母，尤其是酿酒酵母，来表达和分泌胰岛素前体的方法(Thim,L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.83:6766-6770,1986.)。对于使用转基因大肠杆菌的方法，一种方法在大肠杆菌中分别表达了胰岛素的A链和B链，然后在体外混合磺化的A链和B链形成链间二硫键(Rich,D.H.等人，PierceChemicalCompany,Rockford.Pp.721-728，1981；和Frank,B.H.等人，PierceChemicalCompany,Rockford.Pp.729-738，1981.)。然而，这种方法也有缺点，因为它需要两个独立的发酵过程，并形成正确的二硫键。磺化A链和B链之间不恰当的二硫键形成导致胰岛素的产率降低。总的来说，这种方式生产效率很低。据报道，另一种改进的方法，用一个大的融合―压舱物‖(Chang,S.G.等人，Biochem.J.329:631-635,1998；和Rhodes.C.J.In:DiabetesMellitus:AFundamentalandClinicalText3rded.Pp27,2004.)来表达胰岛素原。方法包括：用溴化氰切断融合蛋白，获得胰岛素原。对胰岛素原进行磺化和分离，重折叠磺化胰岛素原形成正确的体外二硫键，然后用胰蛋白酶和羧肽酶B切开C-肽和产物。为了生成胰岛素，聚变―压舱物‖肽的巨大尺寸限制了产量，并可能阻碍重新折叠的过程——在重新折叠之前，需要将融合―压舱物‖去除。采用溴化氰切割大融合蛋白形成了一种工作环境危害，需要高水平的劳动保护。因此，上述工艺需要承担在制备过程中使用繁琐的纯化步骤所造成的不便。另一种方法是由诺和诺德公司开发的(欧洲专利EP0163529，美国专利US4916212)，它包含了由缩短的B链(desThr30)和通过酵母中的三个氨基酸残基(AAK)连接的A链，并通过发酵、纯化、酶切反应、酸性水解和多步纯化等步骤分离出胰岛素。然而，该过程导致胰岛素的产率低得令人无法接受。事实上，酵母所提供的胰岛素产量相对较低。与大肠杆菌相比，酵母表达系统中固有的表达水平较低，发酵周期较长。C-肽在前胰岛素原的折叠中所起的作用还不是很清楚。在C-肽的两端都是两个碱性的位点，被认为是促胰岛素原转化为胰岛素(KroeffEP等人，J.Chromatogr.461:45-61,1989；和Frank,Chance.MunchMed.Wschr.,Suppl1:S14-20,19本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备重组门冬胰岛素及其类似物的新型短门冬胰岛素原序列，其特征在于：包含如公式I所示的氨基酸序列：/nR-R

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种用于制备重组门冬胰岛素及其类似物的新型短门冬胰岛素原序列，其特征在于：包含如公式I所示的氨基酸序列：
R-R
1-(B
1-B
27)-B
28-B
29-B
30-R
2-(A
1-A
21)

其中：
R-R
1是前导肽序列，满足以下条件：

a.R是超氧化物歧化酶同系物的一部分，它由63个氨基酸组成，包括活性甲硫氨酸；
2个半胱氨酸残基由丝氨酸取代；
b.该前导肽不会影响门冬胰岛素原的复性折叠，并且能够被裂解去除；
c.R
1是精氨酸和赖氨酸中的任意一个；

R
2是由精氨酸或者赖氨酸中的任意一个构成的C-肽；

B
1-B
27表示天然人胰岛素B链中B
1-B
27的氨基酸序列；

A
1-A
21表示天然人胰岛素A链；

B
28是天冬氨酸，谷氨酸和脯氨酸中的任意一个，优选为天冬氨酸；

B
29是赖氨酸和脯氨酸中的任意一个，优选为赖氨酸；

B
30是丙氨酸和苏氨酸中的任意一个，优选为苏氨酸。



根据权利要求1所述的门冬胰岛素原序列，其特征在于：所述R的序列是SEQIDNO1或者SEQIDNO2中的一种；
SEQIDNO1序列为：
MATHAVSVLKGDGPVQGIINFEQHESNGPVKVWGSIHGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP；
SEQIDNO2序列为：
MATKAVSVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGSTSAGP。


根据权利要求1所述的门冬胰岛素原序列，其特征在于：所述R
1和R
2是相同的氨基酸，是精氨酸或赖氨酸中的一种。



根据权利要求1所述的门冬胰岛素原序列，其特征在于：所述(B
1-B
27)-B
28-B
29-B
30-R
2-(A
1-A
21)是SEQIDNO12或者SEQIDNO13中的一种；

SEQIDNO12序列为：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKTRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN；
SEQIDNO13序列为：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKTKGIVEQCCTSICSLYQLENYCN。


根据权利要求1所述的门冬胰岛素原序列，其特征在于：所述门冬胰岛素原序列是SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16或SEQIDNO17中的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤传根，潘尚书，刘晓锐，李宬，崔怀言，陈松，张昊宁，丁捷飞，
申请(专利权)人：美药星南京制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32