杂合抗菌肽FW-CP及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种新型杂合抗菌肽FW‑CP及其制备方法和应用。本发明专利技术通过对鸡源抗菌肽Fowlicidin‑2与猪源抗菌肽cecropin P1的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽Fowlicidin‑2与抗菌肽cecropin P1进行拼接，中间加入蛋白Lingker，同时进行部分位点氨基酸突变，获得一种新型杂合抗菌肽FW‑CP，使其抗菌效力获得显著提高。在此基础上，选用毕赤酵母偏爱密码子，人工合成新型杂合抗菌肽FW‑CP基因，克隆于毕赤酵母中表达，获得新型抗菌肽重组酵母菌株，并将发酵规模放大到发酵罐水平，实现抗菌肽产品的高密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后可制成粉剂、液体等抗菌肽制剂用于畜禽疾病的预防和治疗。

Heterozygous Antimicrobial Peptide FW-CP and Its Preparation and Application

The invention provides a novel heterozygous antimicrobial peptide FW CP, a preparation method and application thereof. Based on the analysis of the spatial structure of the amino acid sequence of the chicken antimicrobial peptide Fowlicidin 2 and the pig antimicrobial peptide cecropin P1, the invention splits the antibacterial peptide Fowlicidin 2 and the antibacterial peptide cecropin P1, adding protein Lingker into the middle, and simultaneously carrying out the mutation of part site amino acid, and obtaining a new hybrid antibacterial peptide FW CP, so that its antibacterial effect is significantly improved. \u3002 On this basis, Pichia pastoris preferred codon, synthesized new hybrid antimicrobial peptide FW CP gene artificially, cloned and expressed in Pichia pastoris, obtained a new recombinant yeast strain of antimicrobial peptide, and enlarged the fermentation scale to the level of fermentation tank to achieve high-density fermentation and high-efficiency expression of antimicrobial peptide products. The fermentation broth can be further purified into powder, liquid and other antimicrobial peptide preparations for the prevention and treatment of livestock and poultry diseases.

【技术实现步骤摘要】
杂合抗菌肽FW-CP及其制备方法和应用
本专利技术属于功能基因改造
，具体涉及一种杂合抗菌肽FW-CP及其制备方法和应用。
技术介绍
抗菌肽是生物体内存在的一种具有抗菌活性的小分子蛋白，广泛分布于哺乳动物、甲壳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类、植物、细菌和病毒等生物体内，与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统，是宿主先天性免疫的重要组成部分。鸡源抗菌肽Fowlicidin-2由37个氨基酸组成，是AlessandroTOSSI等于1995年首先从猪骨髓细胞分离得到的。其N端与天蚕素A和B具有相似的结构，对多种革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑制作用，其抗菌活性不受生理盐浓度的影响，甚至在高盐浓度下，仍然保持着良好的抗菌活性，并且具有LPS中和活性，显示了良好的应用前景。猪源抗菌肽cecropinP1是从猪小肠分离出得到的，其含有31个氨基酸残基，分子量是3339Da，不含半胱氨酸，不能形成分子内二硫键，有强碱性的N端和强疏水性的C端，其中酰胺化的C端和螺旋-卷曲-螺旋结构对其广谱抗菌作用极为重要。天然的抗菌肽在临床应用中存在抗菌能力差、抗菌谱窄和副反应大等缺点，限制了其广泛应用。随着对抗菌肽结构功能与杀菌机理研究的深入，人们开始尝试设计杀菌活力更强、抗菌谱更广的杂合抗菌肽。杂合抗菌肽设计通常采用的方法是将不同来源抗菌肽保守序列拼接，以期提高其抗菌活性。目前，国内外已设计合成了许多种杂合肽，抑菌效果明显优于天然肽，且大大降低了毒性和溶血性。本项目组拟以鸡源抗菌肽Fowlicidin-2和猪源抗菌肽cecropinP1为母本，设计获得一种高抑菌能力和抗菌谱的新型杂合抗菌肽FW-CP，用于畜禽疾病的预防和治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种杂合抗菌肽FW-CP，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种杂合抗菌肽FW-CP，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1；本专利技术的杂合抗菌肽FW-CP可用做畜禽饲料添加剂或畜禽疾病的预防和治疗制剂。本专利技术还提供一种杂合抗菌肽FW-CP的重组毕赤酵母的制备方法，其制备步骤如下：1)根据杂合抗菌肽FW-CP的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，连入重组酵母表达载体中，构建成表达重组质粒；2)将构建的表达重组质粒电转化宿主酵母菌，构建能表达杂合抗菌肽FW-CP的重组基因工程酵母菌；用该重组基因工程菌高密度发酵表达出杂合抗菌肽FW-CP；3)对重组表达的杂合抗菌肽FW-CP进一步浓缩、纯化后，测定效价。稀释分装，即为抗菌肽制剂。本专利技术是建立在对鸡源抗菌肽Fowlicidin-2与猪源抗菌肽cecropinP1的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽Fowlicidin-2的N端18个氨基酸与抗菌肽cecropinP1的N端18个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker(PG)，同时进行杂合抗菌肽的4处氨基酸突变(K2V、L13K、G18R和R34A)，并在C末端添加1个N，从而获得一种新型杂合抗菌肽FW-CP，使其抗菌效力获得显著提高。具体实施方式下面结合具体实施方式来进一步描述本专利技术，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的技术方案的情况下可以对本专利技术的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本专利技术保护范围内。实施例1杂合抗菌肽FW-CP及其基因的获得1、利用生物软件对鸡源抗菌肽Fowlicidin-2(GenBank登录号：ADZ99029)和猪源抗菌肽cecropinP1(GenBank登录号：AB186032)的氨基酸序列进行空间结构分析的基础上，将抗菌肽Fowlicidin-2的N端18个氨基酸与抗菌肽cecropinP1的N端18个氨基酸进行拼接，中间加入蛋白Lingker(PG)，获得杂合抗菌肽FC，其氨基酸序列如下：LVQRGRFGRFLRKIRRFRPGSWLSKTAKKLENSAKKRI(SEQIDNO:2)为了增加杂合抗菌肽FC拼接序列中间蛋白Lingker的柔性，将杂合抗菌肽位于18位的精氨酸(R)突变为甘氨酸(G)。同时选择肽2位的缬氨酸(V)和肽34位的丙氨酸(A)用碱性的赖氨酸(K)和精氨酸(R)取代，目的是为了降低两端的疏水性。同时将肽13位的碱性赖氨酸(K)用疏水的亮氨酸(L)取代来补偿由于在肽的非极性面引入亲水性氨基酸所引起的多肽的整体疏水性的降低，并进一步在C末端添加了天冬酰胺(N)以保证抗菌肽C末端的酰胺化。最后共完成杂合抗菌肽的4处氨基酸突变(V2K、K13L、R18G和A34R)，C末端添加1个N，获得一种新型杂合抗菌肽FW-CP，其氨基酸序列如下(SEQIDNO:1):LKQRGRFGRFLRLIRRFGPGSWLSKTAKKLENSRKKRIN。2、根据获得的新型杂合抗菌肽FW-CP的氨基酸序列SEQIDNO:1，按照毕赤酵母基因密码子偏好性进行重新设计，获得编码新型杂合抗菌肽FW-CP的一个核苷酸序列，并在其N端引入Kex2酶切位点。两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中。实施例2基因工程杂合抗菌肽FW-CP表达载体的构建与工程菌的获得1、将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mLZeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。3、将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mLZeocin的YPD培养液中，28℃振摇培养18个小时。取此菌液按5％体积比转接于5mlBMGY培养基中，28℃摇振培养18-24h左右，OD600值约为5-6。培养物直接转接于25mlBMMY培养基中，28℃继续摇振培养。为了维持诱导表达，每隔24h补加100％甲醇使终浓度达1％。48h后，4℃5000r/min离心10min，收集上清，进行抑菌活性测定。能产生抑菌活性的重组酵母菌株即为能产生新型杂合抗菌肽FW-CP的阳性菌株。实施例3发酵、纯化新型杂合抗菌肽FW-CP的制备1、发酵工艺1)将筛选得到的阳性重组子活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以10％接种量接入10L发酵罐(实装培养基6L)，温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM(1L发酵液1min通入的氧气量)，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续72h。2)发酵结束后原罐蒸汽100℃灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。3)新型抗菌肽制剂抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。上述基因工程抗菌肽可做成畜禽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型杂合抗菌肽FW‑CP，其特征在于，所述的杂合抗菌肽FW‑CP的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】
2018.04.04 CN 20181029618151.一种新型杂合抗菌肽FW-CP，其特征在于，所述的杂合抗菌肽FW-CP的氨基酸序列为SEQIDNO:1。2.权利要求1所述的杂合抗菌肽FW-CP的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：1)根据新型杂合抗菌肽FW-CP的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入XhoI和XbaI酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中；2)将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序；3)阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100μg/mLZeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天；待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；4)将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mLZeocin的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王宏华，王艳玲，蒋贻海，魏波，于春梅，武利利，祝俊鹏，黄冬，徐丽丽，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物股份有限公司，青岛动保国家工程技术研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37