一种猪流行性腹泻病毒株的全悬浮细胞培养方法技术

本发明专利技术提供一种针对所筛选的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒株的全悬浮细胞培养方法


[0001]本专利技术属于兽用疫苗细胞培养
，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒株的全悬浮细胞培养方法。
技术背景
[0002]动物细胞大规模培养技术是目前疫苗工业自动化生产工艺的研究主力。悬浮培养标志着细胞大规模培养技术的开始。动物细胞培养生产病毒是病毒疫苗生产过程中常用的方法。目前常用的全悬浮培养细胞有Vero、MDCK、ST、PK
‑
15、BHK
‑
21、Mark
‑
145、LMH等，用于培养口蹄疫病毒、禽流感病毒、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪传染性胃肠炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，俗称“蓝耳病”)等。全悬浮细胞培养降低了使用含牛血清培养基培养带来的高生产成本，也减少了血清中蛋白遗留物或遗留的未知外源病毒对病毒疫苗质量产生的影响。
[0003]ST细胞为猪睾丸细胞(swine testis)，属于成纤维细胞，体外可连续传代贴壁培养。驯化为稳定的全悬浮培养型细胞，需保持表达特性不发生变化，细胞的增殖能力、活力及生产能力均能够满足工业大规模生产的需要。在大规模培养技术中，维持细胞高密度甚至无血清生长，细胞培养基的营养含量对细胞的增殖、维持至关重要。在悬浮培养技术中，不同细胞营养代谢的特异性不同，细胞和病毒培养工艺不同，需要抗剪切力、满足放大功能，还需要提高目标生物制品的稳定性、表达量，这些均需要个性化培养基的支持。在驯化时需要选用合适的细胞培养基，有针对性地补充某些营养成分以满足细胞的特定需求，使驯化好的细胞可以保持其无血清悬浮生长的特性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种针对所筛选的猪流行性腹泻病毒变异株PEDV
‑
AQ株培养用的猪睾丸传代细胞ST细胞系，以及建立的猪流行性腹泻病毒的全悬浮细胞培养方法。
[0005]本专利技术首先提供一种猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST
‑
WL，已于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021214。
[0006]本专利技术所提供的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST
‑
WL用于培养猪流行性腹泻病毒；
[0007]所述的病毒株，为猪流行性腹泻病毒PEDV
‑
AQ株，该病毒株于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:V202164。
[0008]本专利技术再一个方面还提供一种猪流行性腹泻病毒的全悬浮细胞培养方法，包括如下步骤：
[0009]1)制备悬浮细胞培养基
[0010]将DMEM和OPtiMEM培养基按1：2体积比混合均匀，然后添加浒苔提取物和染料木素，至其终浓度分别为10g/L和0.5g/L；
[0011]2)取生长良好的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST
‑
WL株，按细胞密度0.8
×
106cells/ml接入生物反应器中，补加悬浮细胞培养基至最高培养体积，培养条件为60r/min、温度37℃、溶氧30～50％、pH6.8～7.2；
[0012](3)当ST
‑
WL细胞在反应器中的细胞密度达到5
×
106～18
×
106cells/ml，且细胞状态稳定时，调整反应器中细胞密度至2
×
106～6
×
106cells/ml，按照MOI感染数10
‑6接种猪流行性腹泻病毒种毒，同时向培养基中添加聚凝胺，至其终浓度为1μg/ml，反应器控制条件为：37℃，pH7.2，溶氧40％，搅拌速度60r/min；培养68～72h，收获细胞培养液；
[0013](4)将收获的细胞培养液反复冻融2次后，再经过滤澄清去除细胞碎片，得猪流行性腹泻病毒液。
[0014]本专利技术利用驯化得到一株增殖能力强、细胞密度高、适应全悬浮培养的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株ST
‑
WL细胞系，实现了对猪流行性腹泻病毒PEDV
‑
AQ株的全悬浮细胞培养，得到的病毒滴度高，均≥10
9.0
TCIE
50
/ml，明显高于ST细胞贴壁培养的病毒滴度。而且，通过在培养过程中添加聚凝胺，能显著缩短病毒液的收获时间，且病毒滴度也明显提高，从而有利于提高生产效率和批间稳定性，降低生产成本。
附图说明
[0015]图1为ST
‑
WL细胞的悬浮培养状态图；
[0016]图2为ST
‑
WL细胞在生物反应器中生长曲线；
[0017]图3为接毒后ST
‑
WL细胞状态图。
具体实施方式
[0018]申请人筛选获得了一株抗原蛋白基因发生了变异的猪流行性腹泻病毒变异病毒PEDV
‑
AQ株，该病毒株于2021年8月5日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202164。
[0019]该病毒株是从2020年江西省某规模化猪场的腹泻病死仔猪的部分肠道组织及内容物中筛选获得的，该养殖场之前已经使用了猪流行性腹泻病毒商品化疫苗进行了免疫。
[0020]对筛选的PEDV
‑
AQ株的S蛋白序列进行氨基酸同源性进化树分析，发现该分离株与猪流行性腹泻病毒CV777经典株的S蛋白序列同源性最高，为99.6％。比对结果显示：与CV777株相比，该分离毒株S蛋白COE中和表位发生如下突变：第159位氨基酸由V突变为F，第169位氨基酸由V突变为I，第264位氨基酸由L突变为T，第265位氨基酸由L突变为A，第266位氨基酸由H突变为F，第285位氨基酸由R突变为K。
[0021]与市售PEDV灭活疫苗相比，PEDV
‑
AQ株灭活疫苗对流行毒株的攻击具有更好的保护性能。PEDV
‑
AQ株灭活疫苗免疫的母猪生产的仔猪在攻毒后全部获得保护，而市售PEDV灭活疫苗对流行毒株的攻击保护率仅为2/5。
[0022]但使用目前市售的ST贴壁细胞(编号为CVCC NO.CL27中国兽医药品监察所)对PEDV
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AQ株的培养效果并不好，达不到制备疫苗的浓度。因此，通过驯化筛选，获得了能够高效培养PEDV
‑
AQ株的细胞系。
[0023]说明书实施例中涉及的主要生物材料和设备如下：
[0024]ST贴壁细胞种子：编号为CVCC NO.CL27，购买于中国兽医药品监察所，中国微生物菌种保藏管理中心。
[0025]DMEM、OptiMEM细胞培养基：为GIBCO商品化培养基。
[0026]浒苔提取物：为试剂级，上海西宝生物。
[0027]染料木素：为试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪睾丸传代细胞系悬浮适应株，其特征在于，所述的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株的保藏编号为CCTCC NO：C2021214。2.权利要求1所述的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株在培养猪流行性腹泻病毒中的应用。3.一种猪流行性腹泻病毒的全悬浮细胞培养方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的猪睾丸传代细胞系悬浮适应株来培养猪流行性腹泻病毒。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的猪流行性腹泻病毒的保藏编号为CCTCC NO:V202164。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养方法，其中培养基为DMEM培养基和OPtiMEM培养基按1：2体积比混合获得的培养基。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳平，徐宏军，李义星，侯晓岚，董婷婷，杨杰华，赵玉惠，王麒文，张孝智，高杰，韩娜，王宗祥，王少沛，李文华，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：