【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】筏式培养物及其制备方法
[0001]关于联邦资助研发的声明
[0002]本专利技术是根据国立卫生研究院授予的P01 HD093363在政府支持下完成的。政府享有本专利技术的某些权利。
[0003]本公开的各方面总体上涉及食管筏式培养物组合物以及制备所述食管筏式培养物组合物的方法。本文公开的筏式培养物更接近地类似原生器官结构。
技术介绍
[0004]与传统的二维培养系统相比，三维(3D)细胞培养物(如类器官)作为生物功能和发育的模型具有很大的前景。这些3D培养物具有更准确地反映体内存在的器官的特性的潜力，以用于如药理学行为、细胞信号传导、癌症形成和迁移或移植(transplant/grafting)等应用。然而，模拟活生物体中存在的复杂结构的器官组织的体外形成仍然是新兴领域。
技术实现思路
[0005]目前需要更精确的3D器官模型及其例如更有效、更便宜且耗时更少的制作方法。目前还需要任选地避免异种组分的培养制剂，这可能具有重要的安全性和监管意义。本文公开了来自分化的前部前肠细胞的食管筏式培养物及其中间细胞组合物。在一些实施方案中，中间细胞组合物包含背侧前部前肠细胞和/或食管祖细胞。本文还公开了产生所述食管筏式培养物及其中间细胞组合物的方法。在一些实施方案中，该方法包括使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或生长补充剂或它们的任何组合中的一者或多者(例如至少1者、2者、3者、4者)接触，以使该前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞。在一些实施方案中，该方法包括使前...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种体外食管筏式培养物，包括：复层鳞状上皮层，所述复层鳞状上皮层包括基底上层和基底层；以及间充质层，所述间充质层包括肌纤维；其中所述复层鳞状上皮是E
‑
钙粘蛋白
+
，所述基底上层是KRT13
+
和KRT8
+
，并且所述基底层是SOX2
+
、P63
+
和KRT5
+
；并且其中所述间充质层是FOXF1
+
、NKX6
‑1+
和波形蛋白
+
，并且所述肌纤维是结蛋白
+
。2.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物缺乏固有层，或者与来自和所述筏式培养物相同物种的成年动物的食管组织相比具有减少的固有层。3.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物，还包括生长培养基，任选地DMEM/F12。4.根据前述权利要求中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物位于插入构件中和/或其表面上，所述插入构件包括能够渗透所述生长培养基但无法渗透细胞的表面，并且所述插入构件定位在组织培养容器内；并且任选地其中所述食管筏式培养物定位在能够渗透所述生长培养基但无法渗透细胞的表面上。5.根据权利要求4所述的食管筏式培养物，其中所述插入构件的至少一部分，任选地能够渗透所述生长培养基但无法渗透细胞的所述表面，包被有细胞外基质或其组分。6.根据权利要求5所述的食管筏式培养物，其中所述细胞外基质或其组分衍生自人。7.根据权利要求5或6所述的食管筏式培养物，其中所述细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。8.根据权利要求5至7中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。9.根据权利要求4至8中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述插入构件和/或组织培养容器含有一定量的生长培养基，使得所述食管筏式培养物完全浸没在所述生长培养基中。10.根据权利要求9所述的食管筏式培养物，其中包含在所述插入构件内的所述生长培养基还包括EGF通路活化剂、ROCK抑制剂、SMAD抑制剂或它们的任何组合，并且包含在所述组织培养容器内的所述生长培养基包括EGF通路活化剂。11.根据权利要求4至8中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得所述食管筏式培养物仅部分地浸没在所述生长培养基中，其中所述复层鳞状上皮仅部分地浸没或不浸没在所述生长培养基中，并且形成气
‑
液界面和/或位于所述气
‑
液界面处。12.根据权利要求11所述的食管筏式培养物，其中包含在所述组织培养容器内的所述生长培养基包括EGF通路活化剂。13.根据权利要求4至12中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述插入构件的能够渗透的表面包括为、为约、为至少、为至少约、不超过或不超过约0.1μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4
μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm或10μm的孔径，或由前述尺寸中的任何两个所限定的范围内的任何孔径。14.根据权利要求4至13中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述插入构件的能够渗透的表面包括3μm的孔径。15.根据权利要求1至14中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII
‑
微管蛋白+神经元细胞。16.根据权利要求1至14中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物还包括肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII
‑
微管蛋白+神经元细胞，使得所述食管筏式培养物是受神经支配的食管筏式培养物，任选地其中所述神经元祖细胞是SOX10+。17.根据权利要求1至16中任一项所述的食管筏式培养物，其中所述食管筏式培养物不具有血管形成、血管和/或内皮细胞。18.一种体外细胞培养物，包括：衍生自背侧前部前肠细胞的食管祖细胞群，所述背侧前部前肠细胞已经用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理。19.根据权利要求18所述的细胞培养物，其中所述背侧前部前肠细胞还已经用神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。20.根据权利要求18或19所述的细胞培养物，还包括生长培养基，任选地无血清培养基，任选地角质形成细胞SFM。21.根据权利要求20所述的细胞培养物，其中所述生长培养基包括EGF通路活化剂或牛垂体提取物(BPE)或两者。22.根据权利要求21所述的细胞培养物，其中：所述EGF通路活化剂的浓度为约1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL或20ng/mL，或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度；或者所述BPE的浓度为约5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL或100μg/mL，或由前述浓度中的任何两个所限定的范围内的任何浓度，或两者。23.根据权利要求18至22中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物位于组织培养容器中和/或其表面上。24.根据权利要求23所述的细胞培养物，其中所述组织培养容器的至少一部分包被有细胞外基质或其组分，并且所述食管祖细胞群位于所述部分上或与所述部分接触。25.根据权利要求24所述的细胞培养物，其中所述细胞外基质或其组分衍生自人。26.根据权利要求24或25所述的细胞培养物，其中所述细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。27.根据权利要求24至26中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。28.根据权利要求18至27中任一项所述的细胞培养物，还包括ROCK抑制剂。29.根据权利要求18至28中任一项所述的细胞培养物，还包括肠神经嵴细胞。
30.一种体外细胞培养物，包括：用EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合进行处理的前部前肠细胞群。31.根据权利要求30所述的细胞培养物，其中所述前部前肠细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。32.根据权利要求30或31所述的细胞培养物，还包括生长培养基，任选地RPMI，任选地具有FBS，任选地0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％或2.5％的FBS，或由前述百分比中的任何两个所限定的范围内的任何百分比的FBS。33.根据权利要求30至32中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物位于组织培养容器中和/或其表面上。34.根据权利要求1至17中任一项所述的食管筏式培养物，或根据权利要求18至33中任一项所述的细胞培养物，其中所述食管筏式培养物或细胞培养物已经生长了至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。35.根据权利要求34所述的食管筏式培养物或细胞培养物，其中所述食管筏式培养物或所述细胞培养物已从人诱导性多能干细胞中衍生出。36.根据权利要求34或35所述的食管筏式培养物或细胞培养物，其中所述食管筏式培养物或所述细胞培养物不衍生自球状体或类器官。37.一种产生食管筏式培养物的方法，包括：(a)使前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BMP通路抑制剂、FGF通路活化剂或它们的任何组合接触，以使所述前部前肠细胞分化为背侧前部前肠细胞；(b)将来自步骤(a)的所述背侧前部前肠细胞解离成单个细胞；(c)在第一组织培养容器中培养所述背侧前部前肠细胞，以使所述背侧前部前肠细胞分化为食管祖细胞；(d)将来自步骤(c)的所述食管祖细胞解离成单个细胞；(e)在插入构件中和/或插入构件的表面上培养所述食管祖细胞，其中所述插入构件定位在第二组织培养容器内；其中所述插入构件包括能够渗透生长培养基但无法渗透细胞的表面；并且其中所述插入构件和第二组织培养容器各自含有一定量的生长培养基，使得所述食管祖细胞完全浸没在所述生长培养基中；以及(f)在所述插入构件中培养所述食管祖细胞，其中所述第二组织培养容器和/或插入构件含有一定量的生长培养基，使得所述食管祖细胞仅部分地浸没在所述生长培养基中。38.根据权利要求37所述的方法，其中使所述前部前肠细胞进一步与神经元祖细胞抑制剂任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷接触。39.根据权利要求37或38所述的方法，其中使用解离酶任选地胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶或Accutase对所述食管祖细胞进行解离。40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述第一组织培养容器和/或所述第二组织培养容器的至少一部分包被有细胞外基质或其组分。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分衍生自人。42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分包括人IV型胶原。43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中所述细胞外基质或其组分不包括大鼠I型胶原基质或基质胶。44.根据权利要求37至43中任一项所述的方法，其中(a)的接触步骤进行至少1天、2天、3天、4天或5天。45.根据权利要求37至44中任一项所述的方法，其中(c)的培养步骤进行至少1天、2天、3天、4天或5天。46.根据权利要求37至45中任一项所述的方法，其中(e)的培养步骤进行至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。47.根据权利要求37至46中任一项所述的方法，其中(f)的培养步骤进行至少10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天或20天。48.根据权利要求37至47中任一项所述的方法，其中将步骤(c)的所述背侧前部前肠细胞与EGF通路活化剂、BPE、ROCK抑制剂或它们的任何组合一起培养。49.根据权利要求37至48中任一项所述的方法，其中将步骤(e)的所述食管祖细胞与EGF通路活化剂、ROCK抑制剂、SMAD抑制剂或它们的任何组合一起在所述插入构件的所述生长培养基中培养，并与EGF一起在所述第二组织培养容器的所述生长培养基中培养。50.根据权利要求37至49中任一项所述的方法，其中将步骤(f)的所述食管祖细胞与EGF通路活化剂一起在所述第二组织培养容器的所述生长培养基中培养。51.根据权利要求37至50中任一项所述的方法，其中所述前部前肠细胞已从人诱导性多能干细胞中衍生出。52.根据权利要求37至51中任一项所述的方法，其中所述前部前肠细胞已从定形内胚层细胞中衍生出，其中所述定形内胚层细胞已从人诱导性多能干细胞中衍生出。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述定形内胚层细胞已经用Wnt3a、FGF4、Noggin或RA或它们的任何组合进行处理，以使所述定形内胚层细胞分化为前部前肠细胞。54.根据权利要求53所述的方法，其中已将所述定形内胚层细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂，任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中已将所述定形内胚层细胞处理1天、2天、3天、4天或5天。56.根据权利要求51至55中任一项所述的方法，其中已将所述人诱导性多能干细胞用BMP4和/或活化素A处理，以使所述人诱导性多能干细胞分化为定形内胚层细胞。57.根据权利要求56所述的方法，其中已将所述人诱导性多能干细胞进一步用神经元祖细胞抑制剂，任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷进行处理。58.根据权利要求51至57中任一项所述的方法，其中已将所述人诱导性多能干细胞处理1天、2天、3天、4天或5天。59.根据权利要求37至58中任一项所述的方法，还包括：使人诱导性多能干细胞与BMP4和/或活化素A接触，以使所述人诱导性多能干细胞分化为定形内胚层细胞；以及使所述定形内胚层细胞与Wnt、FGF4、Noggin或RA或它们的任何组合接触，以使所述定
形内胚层细胞分化为步骤(a)的所述前部前肠细胞。60.根据权利要求59所述的方法，其中使所述人诱导性多能干细胞和/或所述定形内胚层细胞进一步与神经元祖细胞抑制剂，任选地CultureOne补充剂或阿糖胞苷接触。61.根据权利要求59或60所述的方法，其中使所述人诱导性多能干细胞接触1天、2天、3天、4天或5天。62.根据权利要求59至61中任一项所述的方法，其中使所述定形内胚层细胞接触1天、2天、3天、4天或5天。63.根据权利要求37至62中任一项所述的方法，其中所述食管筏式培养物有效地不含神经元祖细胞和/或βIII
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微管蛋白+神经元细胞。64.根据权利要求37至63中任一项所述的方法，还包括将步骤(d)的解离后的食管祖细胞与肠神经嵴细胞(ENCC)组合，并根据步骤(e)和(f)培养组合后的食管祖细胞和ENCC，以产生受神经支配的食管筏式培养物。65.根据权利要求64所述的方法，其中所述受神经支配的食管筏式培养物包括肠神经嵴细胞(ENCC)、神经元祖细胞和/或βIII
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