新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，已于2021年05月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202144，保藏地址为：中国武汉武汉大学。本发明专利技术还公开了以该致弱毒株为种毒的新型鸭呼肠孤病毒活疫苗。本发明专利技术的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，是在鸡胚成纤维细胞上传代后经克隆纯化而得的自然缺失弱毒株，毒力显著降低，接种雏鸭无不良反应，是具有较高安全性的疫苗候选弱毒株。以该弱毒株研制的疫苗免疫雏鸭可有效抵挡强毒攻击，安全性高，不返强，遗传稳定性好。好。好。

【技术实现步骤摘要】
新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株及其应用


[0001]本专利技术涉及一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株及其应用，属于动物医学疫苗领域。

技术介绍

[0002]禽呼肠孤病毒(avian reovirus，ARV)属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属，病毒粒子无囊膜，为20面体对称，基因组为线性双股RNA，分10个节段，极易发生基因重配与突变。该病毒宿主广泛，可感染多种禽类。
[0003]目前禽呼肠孤病毒在我国主要存在3种不同致病型：1、由鸡呼肠孤病毒(Chicken reovirus,CRV)引起的鸡病毒性关节炎、矮小综合征等，主要表现关节炎、腱鞘炎、生长发育不良；2、由番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)引起的番鸭、鹅“花肝病”，主要表现肝脏有黄白色坏死灶；3、由新型鸭呼肠孤病毒(Novel Duck Reovirus,NDRV)引起的鸭鹅“脾坏死病”，主要表现肝脾坏死和出血。造成这3种疾病的禽类呼肠孤病毒无论从流行病学、临床症状和病理变化，还是从基因序列和血清学等方面，均表现出较大的差异。
[0004]新型鸭呼肠孤病毒可以感染樱桃谷鸭、麻鸭、番鸭、半番鸭、野鸭、鹅等多个水禽品种，主要引起雏鸭发病死亡，成年鸭感染不表现症状，但能垂直传播，引起后代雏鸭发病。该病在2005年前后在中国南方一些省份，如福建、广东、浙江等地的鸭群中开始出现，后蔓延至全国主要养鸭区。目前该病在中国已成为常见病、多发病。发病日龄一般为5～25日龄，其中以7～14日龄居多，发病率5％～35％，死亡率2％～20％，一般发病鸭日龄愈小，发病率和死亡率愈高。该病毒能引起患鸭脾脏坏死、法氏囊损伤，导致免疫抑制，极易继发细菌感染，且很难治疗，从而造成更高的死亡率，给我国的养鸭业造成了很大的经济损失。目前该病尚无商品化的疫苗。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术，本专利技术提供了一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，及其在防治新型鸭呼肠孤病毒中的应用，在制备新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗中的应用，在制备防治新型鸭呼肠孤病毒的药物中的应用。
[0006]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0007]一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株——DE150株，已于2021年05月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202144，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。
[0008]该毒株是由强毒株DE株突变而得，突变至少包括以下5个σC基因上的核苷酸突变位点和4个氨基酸突变位点：
[0009]核苷酸突变位点：第41位C突变为T，第201位C突变为T，第218位T突变为G，第851位T突变为C，第924位T突变为G；
[0010]氨基酸突变位点：第14位P突变为L，第73位L突变为R，第284位L突变为S，第308位N
突变为K。
[0011]所述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在防治新型鸭呼肠孤病毒中的应用。
[0012]所述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗中的应用。
[0013]所述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备防治新型鸭呼肠孤病毒的药物中的应用。
[0014]所述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备防治由新型鸭呼肠孤病毒引起的疾病的药物中的应用。
[0015]一种新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗，是以上述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株为种毒的新型鸭呼肠孤病毒活疫苗。
[0016]所述新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫苗，可通过以下方法制备得到：将上述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在鸡胚成纤维细胞上传代培养，病毒滴度达到10
3.50
TCID
50
/0.1ml以上，加入冻干保护剂制成弱毒疫苗。
[0017]一种用于诊断新型鸭呼肠孤病毒的检测抗原，为上述新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株的病毒颗粒。
[0018]本专利技术的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，是在鸡胚成纤维细胞上传代后经克隆纯化而得的自然缺失弱毒株，毒力显著降低，接种雏鸭无不良反应，是具有较高安全性的疫苗候选弱毒株。以该弱毒株研制的疫苗免疫雏鸭可有效抵挡强毒攻击，安全性高，不返强，遗传稳定性好。
[0019]本专利技术使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本专利技术所表述的含义为准。
附图说明
[0020]本专利技术的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株——DE150株，已于2021年05月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202144，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。
[0021]图1：ED150株的透射电镜照片。
[0022]图2：接种后第5、10、15和20日包括脾脏在内的组织器官的示意图。
[0023]图3：10
3.5
TCID
50
/羽、10
4.0
TCID
50
/羽、10
4.5
TCID
50
/羽、10
5.0
TCID
50
/羽免疫组和对照组鸭的脾脏示意图。
具体实施方式
[0024]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。
[0025]本专利技术对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本专利技术目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本专利技术仍然在此作尽可能详细描述。
[0026]下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有
的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0027]实施例1新型鸭呼肠孤病毒DE150弱毒株的培育与鉴定
[0028]1.新型鸭呼肠孤病毒DE株的分离鉴定
[0029]1.1发病情况 山东东阿地区一家较大规模的樱桃谷肉鸭养殖场，新进的一批雏鸭在9日龄时出现采食下降，精神沉郁，少部分出现死亡。死亡雏鸭剖检发现，脾脏坏死、硬化，取病变明显的脾组织用于病原分离。
[0030]1.2病毒分离与RT
‑
PCR鉴定 取病变脾脏加入5倍体积的无菌生理盐水，充分研磨，冻融3次，8000g离心30min，取上清用0.22μm滤器过滤除菌，通过尿囊腔接种9日龄樱桃谷鸭胚，每天观察两次，直至接种后第7天。观察死亡鸭胚的病变情况，并用其尿囊液继续盲传至第3代，标记为DE。按照常规方法提取DE株第3代尿囊液的核酸，利用引物P
‑
F/P
‑
R，通过RT
‑
PCR方法进行新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)核酸检测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，已于2021年05月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202144，保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072。2.根据权利要求1所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株，其特征在于：是由强毒株DE株突变而得，突变至少包括以下5个σC基因上的核苷酸突变位点和4个氨基酸突变位点：核苷酸突变位点：第41位C突变为T，第201位C突变为T，第218位T突变为G，第851位T突变为C，第924位T突变为G；氨基酸突变位点：第14位P突变为L，第73位L突变为R，第284位L突变为S，第308位N突变为K。3.权利要求1或2所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在防治新型鸭呼肠孤病毒中的应用。4.权利要求1或2所述的新型鸭呼肠孤病毒传代致弱毒株在制备新型鸭呼肠孤病毒弱毒疫...

【专利技术属性】
技术研发人员：于可响，黄兵，李玉峰，丛雁方，于春梅，商敏，路晓，刘丽萍，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：