一种检测猴G-CSF的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测猴G‑CSF的双抗夹心酶联免疫试剂盒，包括由捕获抗体包被的酶标板、检测抗体、稀释液、浓缩洗涤液、偶联物、显色液、终止液和标准品；其中，捕获抗体为G‑CSF的单克隆抗体；检测抗体为生物素标记的G‑CSF多克隆抗体；稀释液为0.5～2%干酪素钠的pH7.4磷酸缓冲液；捕获抗体包被在酶标板上，以质量分数1～4%干酪素钠的pH7.4磷酸缓冲液作为封闭液进行抗体封闭；标准品为G‑CSF蛋白。本发明专利技术采用三明治法半定量ELISA的检测样品的G‑CSF的水平，检测方法操作简单，结果准确度高，能够检测大批量的样品。适用于科研领域非临床诊断目的的针对猴G‑CSF的特异性检测，有很大的推广应用价值。

An Enzyme-linked Immunoassay Kit for Detecting Monkey G-CSF

The invention discloses a double-antibody sandwich enzyme-linked immunoassay kit for detecting monkey G_CSF, which comprises an enzyme plate coated with captured antibody, detection antibody, dilution solution, concentrated detergent, conjugate, chromogenic solution, termination solution and standard substance, in which the captured antibody is a monoclonal antibody of G_CSF, the detection antibody is a biotin-labeled G_CSF polyclonal antibody, and the dilution solution is 0.5-2% dry. The capturing antibody was coated on the enzyme label plate and blocked with the pH 7.4 phosphate buffer of 1-4% casein sodium as the blocking solution. The standard product was G_CSF protein. The present invention adopts sandwich semi-quantitative ELISA to detect the G_CSF level of samples. The detection method has simple operation, high accuracy and can detect large quantities of samples. It is suitable for the specific detection of monkey G CSF for non-clinical diagnostic purposes in the field of scientific research, and has great application value.

【技术实现步骤摘要】
一种检测猴G-CSF的酶联免疫试剂盒
本专利技术涉及生物体外诊断
，更具体地，涉及一种检测猴G-CSF的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
集落刺激因子(Colonystimulatingfactor，CSF)，是一类可刺激不同的造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落的细胞因子。根据集落刺激因子的作用范围，分别命名为粒细胞CSF(G-CSF)，巨噬细胞CSF(M-CSF)，粒细胞和巨噬细胞CSF(GM-CSF)和多能集落刺激因子(multi-CSF，又称IL-3)。它们对不同发育阶段的造血干细胞起促增殖、分化的作用，是血细胞发生必不可少的刺激因子。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)主要由内毒素、TNF-α和IFN-γ可活化单核细胞和巨噬细胞产生，具有刺激粒系母细胞的增殖和分化，并可增强成熟粒细胞功能的作用。它在抗感染的非特异性细胞免疫过程中起重要作用。当化脓菌或其毒素侵人人体时，G-CSF在血清或体液中迅速升高，并在感染得到控制后又降至正常水平。在科研领域，非临床诊断目的的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)检测有着很大的市场前景。但是，目前市场上尚适用于科研领域非临床诊断目的的针对猴G-CSF的特异性检测试剂盒，缺乏一种操作简单、检测灵敏度高、准确性强的猴G-CSF的酶联免疫试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的缺乏一种操作简单、检测灵敏度高、准确性强的猴G-CSF的酶联免疫试剂盒不足，提供一种操作简单、检测灵敏度高、准确性强的猴G-CSF的酶联免疫试剂盒。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利技术的技术方案是将捕获抗体包被于酶标板，加入检测抗体和G-CSF蛋白后，形成捕获抗体、抗原和检测抗体的复合物。待加入偶联物和显色液后，终止反应并读取样品的吸光值。通过与标准曲线比较计算得到待测样品中的G-CSF的含量。一种检测猴G-CSF的双抗夹心酶联免疫试剂盒，包括由捕获抗体包被的酶标板、检测抗体、稀释液、浓缩洗涤液、偶联物、显色液、终止液和标准品；其中，捕获抗体为G-CSF的单克隆抗体；检测抗体为生物素标记的G-CSF多克隆抗体；稀释液为0.5～2％干酪素钠的pH7.4磷酸缓冲液；捕获抗体包被在酶标板上，以质量分数1～4％干酪素钠的pH7.4磷酸缓冲液作为封闭液进行抗体封闭；标准品为G-CSF蛋白。优选地，捕获抗体为抗人G-CSF的单克隆抗体。优选地，检测抗体为生物素标记的G-CSF羊多克隆抗体。G-CSF蛋白为NCBIReferenceSequence：XP_001095097.1。G-CSF蛋白为大肠杆菌表达的G-CSF。优选地，标准品为G-CSF蛋白冻干品。优选地，捕获抗体G-CSF抗原包被在酶标板上，包括以下步骤：S11.用pH9.4磷酸盐缓冲液将捕获抗体稀释，加入酶标板，预包被；S12.用含有体积分数0.01～0.2％吐温20的pH7.4的PBS洗涤S1包被后的酶标板；S13.拍干，加入封闭液，封闭；S14.拍干，干燥，真空包装，保存。优选地，步骤S11中，包被的条件为1～10℃，不少于12小时。优选地，步骤S12中，用含有0.05％吐温20的PBS洗涤S1的酶标板。优选地，步骤S13中，封闭的条件为25～37℃，2～8小时。更优选地，步骤S13中，封闭的条件为25℃，4小时。优选地，步骤S14中，干燥的条件为25～37℃，4～12小时，10％～60％湿度。更优选地，步骤S14中，干燥的条件为25℃，6小时，30％湿度。优选地，步骤S14中，保存的条件为4～25℃。更优选地，步骤S14中，保存的条件4℃。优选地，捕获抗体的包被浓度为0.625～5μg/ml，包被量为50～300μL。更优选地，捕获抗体的包被浓度为2.5μg/ml，包被量为100μL。优选地，检测抗体的使用浓度为0.25～2μg/ml，使用量为50～300μL。更优选地，检测抗体的使用浓度为1μg/ml，使用量为50μL。优选地，浓缩洗涤液为含有体积分数1～4％的吐温的pH7.4的磷酸盐缓冲液，工作浓度需要稀释20倍。更优选地，浓缩洗涤液为含有体积分数0.5％的吐温的pH7.4的磷酸盐缓冲液，工作浓度需要稀释20倍。优选地，偶联物为辣根过氧化酶标记的链霉亲和素，其工作浓度为0.1～1.0μg/ml。更优选地，偶联物的工作浓度为0.25μg/ml。优选地，显色液为质量分数为0.01～0.05％四甲基联苯胺。更优选地，显色液为质量分数为0.02％四甲基联苯胺。优选地，终止液为1～4mol/L硫酸。更优选地，终止液为2mol/L硫酸。以上所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒的使用方法，包括以下步骤：S21.向酶标板，加入检测抗体；S22.将用稀释液梯度稀释的标准品和待测样本分别加入对应的孔内，振荡混匀，室温孵育；S23.用洗涤液洗涤酶标板；S24.加入偶联物，振荡混匀，室温孵育；S25.用洗涤液洗涤酶标板；S26.加入显色液，振荡混匀，室温避光显色；S27.加入终止液，终止反应；S28.分别检测450nm及620nm的OD值，计算其差值；S29.以OD450与OD620的差值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，得到标准曲线和线性回归方程式；S210.将待测样本的OD450与OD620的差值带入线性回归方程式，计算其浓度。优选地，步骤S21中，加入检测抗体的量为50～300μL/孔。更优选地，步骤S21中，加入检测抗体的量为50μL/孔。优选地，步骤S22中，加入抗原或待测样本的量为50～300μL/孔。更优选地，步骤S22中，加入抗原或待测样本的量为50μL/孔。优选地，步骤S22中，孵育时间为1～3h。更优选地，步骤S22中，孵育时间为2h。优选地，步骤S23中，洗涤酶标板为洗涤液200～400μL/孔，洗涤2～6次，每次20～60秒，拍干。更优选地，步骤S23中，洗涤酶标板为洗涤液300μL/孔，洗涤3次，每次30秒，拍干。优选地，步骤S24中，加入偶联物的量50～200μL/孔。更优选地，步骤S24中，加入偶联物的量100μL/孔。优选地，步骤S24中，孵育时间为15～60min。更优选地，步骤S24中，孵育时间为30min。优选地，步骤S25中，洗涤预包被为洗涤液200～400μL/孔，洗涤2～6次，每次20～60秒，拍干。更优选地，步骤S25中，洗涤酶标板为洗涤液300μL/孔，洗涤5次，每次30秒，拍干。优选地，步骤S26中，加入显色液的量50～200μL/孔。更优选地，步骤S26中，加入显色液的量100μL/孔。优选地，步骤S26中，显色时间为5～30min。更优选地，步骤S26中，显色时间为15min。优选地，步骤S27中，加入终止液的量25～100μL/孔。更优选地，步骤S27中，加入终止液的量50μL/孔。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术采用三明治法半定量ELISA的检测样品的G-CSF的水平，检测方法操作简单，结果准确度高，能够检测大批量的样品。适用于科研领域非临床诊断目的的针对猴G-CSF的特异性检测，有很大的推广应用价值。附图说明图1为实施例1中猴G-CSF标准品检测标准曲线。图2为实施例3中选择一步法得到的猴G-CSF标准品标准曲线。图3为实施例3中选择二步法得到的猴G-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测猴G‑CSF的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括由捕获抗体包被的酶标板、检测抗体、稀释液、浓缩洗涤液、偶联物、显色液、终止液和标准品；其中，捕获抗体为G‑CSF的单克隆抗体；检测抗体为生物素标记的G‑CSF多克隆抗体；稀释液为0.5～2%干酪素钠的pH7.4磷酸缓冲液；捕获抗体包被在酶标板上，以质量分数1～4%干酪素钠的pH7.4磷酸缓冲液作为封闭液进行抗体封闭；标准品为G‑CSF蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种检测猴G-CSF的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括由捕获抗体包被的酶标板、检测抗体、稀释液、浓缩洗涤液、偶联物、显色液、终止液和标准品；其中，捕获抗体为G-CSF的单克隆抗体；检测抗体为生物素标记的G-CSF多克隆抗体；稀释液为0.5～2%干酪素钠的pH7.4磷酸缓冲液；捕获抗体包被在酶标板上，以质量分数1～4%干酪素钠的pH7.4磷酸缓冲液作为封闭液进行抗体封闭；标准品为G-CSF蛋白。2.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，捕获抗体G-CSF抗原包被在酶标板上，包括以下步骤：S11.用pH9.4磷酸盐缓冲液将捕获抗体稀释，加入酶标板，预包被；S12.用含有体积分数0.01～0.2%吐温20的pH7.4的PBS洗涤S1包被后的酶标板；S13.拍干，加入封闭液，封闭；S14.拍干，干燥，真空包装，保存。3.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，捕获抗体的包被浓度为0.625～5μg/ml，包被量为50～300μL。4.根据权利要求3所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，捕获抗体的包被浓度为2.5μg/ml，包被量为100μL。5.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，检测抗体的使用浓度为0.25～2μg/ml，使用量为50～...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕利军，朱国峰，张晓莉，温姌婷，姚青青，李燕，黄健乐，苏欣莹，
申请(专利权)人：广东云天抗体生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44