循环肿瘤细胞的捕获方法及捕获试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种循环肿瘤细胞的捕获方法及捕获试剂盒。其中，该捕获方法包括以下步骤：S1，利用淋巴细胞分离液对外周血中的细胞进行分离，取得白膜层细胞；S2，利用EpCAM抗体和Vimentin抗体捕获白膜层细胞中的循环肿瘤细胞。应用本发明专利技术的技术方案，通过增加间质型标记(Vimentin，波形蛋白)抗体，与EpCAM抗体混合后进行CTC的捕获，不仅能够捕获常规的上皮型CTC，还能捕获危险性更大的发生了EMT转化的CTC，能够极大的提高捕获效率，提高CTC的检出率。

【技术实现步骤摘要】
循环肿瘤细胞的捕获方法及捕获试剂盒
本专利技术涉及生物医学
，具体而言，涉及一种循环肿瘤细胞的捕获方法及捕获试剂盒。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)是从肿瘤病灶脱离并播散到血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。大量实验已经证实CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。由于转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC被视为转移的种子。基于人类肿瘤细胞株和小鼠模型的研究显示，发生上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)的肿瘤细胞在肿瘤转移中起到非常关键的作用。上皮细胞-间充质转化，是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。免疫磁性分离技术(immunomagneticseparation,IMS)是近年来国内外研究的一种新的免疫学技术，它能够从大量外周血中筛选出带有特异性标记的肿瘤细胞，其基本原理主要是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，形成细胞-抗原-抗体-磁珠免疫复合物，该复合物在外加磁场的作用下发生力学移动，将含有靶抗原的目的细胞与其他细胞分离，从而达到特异性分离细胞的目的。具体分为阳性富集方法和阴性富集方法。前者通过磁珠偶联上皮细胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule,EpCAM)和细胞角蛋白(cytokerins,CKs)等标志直接富集外周血中上皮来源的稀有细胞。后者通过磁珠偶联CD45等白细胞标志，去除外周血白细胞而间接富集稀有上皮细胞。目前基于免疫磁性原理富集或同时检测CTCs的技术主要有CellSearch系统、免疫磁性细胞分选仪(magnetriccellsorting,MACS)、AdnaTest癌细胞检测系统和莱尔系统等。其中CellSearch检测系统已经被美国FDA批准用于检测乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者外周血的CTCs。该系统利用EpCAM抗体结合表达EpCAM的肿瘤细胞，然后用免疫磁珠来覆盖抗EpCAM抗体，最后在磁场的作用下对CTCs进行分离。将分离得到的细胞经固定后用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidinedihydrochloride,DAPI)荧光染料标记细胞核，CD45荧光抗体和CK8、CK18、CK19或CKmix荧光抗体标记细胞，结果分析在四色荧光显微镜下进行。将DAPI+、CD45-、CK+和EpCAM+的细胞定义为CTCs。CellSearch系统的优点是细胞形态结构能够较好保存，即通过荧光显微镜看到荧光染色的结果，直接观察到肿瘤细胞的形态。因为CellSearch系统被美国国家医保Medicare所认可，所以在美国该系统在临床上有广泛的应用。但CellSearch系统自身也有无法解决的缺陷：首先是检测的灵敏度不够高。由于该系统采用的EpCAM免疫磁珠捕获CTC，捕获效率对细胞表面抗原的表达情况依赖较明显。有研究证实并非所有的肿瘤细胞都会表达EpCAM且其表达的强弱在不同细胞表面差异较大，因此EpCAM难以作为通用的识别抗原。同时，一些CTC由于发生EMT过程，导致缺失表皮抗原的表达而不能被捕获。乳腺癌细胞一旦发生EMT转化，就要比未发生EMT的癌细胞活动能力更强，容易发生脑、肝、肺、骨等转移，另外EMT过程还会导致癌细胞增殖停滞，损害化疗敏感性，所以发生了EMT转化的乳腺癌细胞在血液中存活率更高、危险性更大。但因为细胞发生EMT转化，细胞表面上皮型的marker会丢失，所以无法被结合了EpCAM抗体的免疫磁珠捕获，导致重要临床信息的丢失。另外，部分癌症转移期患者由于其血液中CTC含量过低，也不能被CellSearch系统所捕获，因此该检测存在假阴性率较高的问题。Cellsearch系统的检测还需要特定的仪器、试剂以及耗材，且均价格不菲，限制了其进一步大规模应用于临床。此外，CTC在外周血中的含量极低，一般认为在外周血中大约105～107个单核细胞中才有一个CTC，cellsearch的方法在CTC的富集过程中只利用EpCAM抗体进行一次阳性富集，这样会导致大量的白细胞被非特异性的富集下来，为后续CTC的染色鉴定带来很大干扰。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种循环肿瘤细胞的捕获方法及捕获试剂盒，以提高CTC捕获的敏感性。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种循环肿瘤细胞的捕获方法。该捕获方法包括以下步骤：S1，利用淋巴细胞分离液对外周血中的细胞进行分离，取得白膜层细胞；S2，利用EpCAM抗体和Vimentin抗体捕获白膜层细胞中的循环肿瘤细胞。进一步地，S2具体包括中，向含有白膜层细胞的液体中加入EpCAM抗体和Vimentin抗体，孵育后，弃上清，重悬抗体细胞混合物加入链霉亲和素磁珠或亲和素磁珠孵育，与链霉亲和磁珠或亲和素磁珠结合的细胞为最终捕获到的循环肿瘤细胞。进一步地，S2中：重悬抗体细胞混合物加入链霉亲和素磁珠孵育后还包括将磁珠抗体细胞混合物贴在磁力架上，待上清清澈后，将上清吸出，加入洗涤液混匀后再次贴在磁力架上，待上清清澈后，将上清吸出，重复操作多次，得到循环肿瘤细胞。进一步地，在S1和S2之间还包括：去除白膜层细胞中的白细胞，得到第一上清液；第一上清液即为含有白膜层细胞的液体；优选的，利用CD45磁珠去除白膜层细胞中的白细胞。进一步地，淋巴细胞分离液为Ficoll淋巴细胞分离液。进一步地，S1具体包括：用PBS将外周血进行稀释，得到稀释后的外周血；Ficoll淋巴细胞分离液盛放在离心管中，将稀释后的外周血加入Ficoll淋巴细胞分离液的上层，室温离心，取中间的白膜层用PBS进行洗涤，得到白膜层细胞。进一步地，捕获方法还包括：S4，免疫荧光染色检测捕获的细胞数量。进一步地，S4具体包括：S41，将分离得到的循环肿瘤细胞固定后用DAPI荧光染料标记细胞核；S42，用CD45绿色荧光抗体标记细胞；S43，用CKmix、EpCAM、vimentin红色荧光抗体标记细胞；S44，在三色荧光显微镜下进行结果分析，将DAPI+、CD45-、CKmix+或EpCAM+或vimentin+的细胞定义为CTCs。根据本专利技术的另一方面，提供了一种循环肿瘤细胞的捕获试剂盒。该试剂盒包括：淋巴细胞分离液、CD45磁珠和EpCAM抗体。进一步地，捕获试剂盒还包括Vimentin抗体；优选的，捕获试剂盒还包括链霉亲和磁珠或亲和素磁珠。应用本专利技术的技术方案，通过增加间质型标记(Vimentin，波形蛋白)抗体，与EpCAM抗体混合后进行CTC的捕获，不仅能够捕获常规的上皮型CTC，还能捕获危险性更大的发生了EMT转化的CTC，能够极大的提高捕获效率，提高CTC的检出率。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种循环肿瘤细胞的捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，利用淋巴细胞分离液对外周血中的细胞进行分离，取得白膜层细胞；S2，利用EpCAM抗体和Vimentin抗体捕获所述白膜层细胞中的循环肿瘤细胞。

【技术特征摘要】
1.一种循环肿瘤细胞的捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，利用淋巴细胞分离液对外周血中的细胞进行分离，取得白膜层细胞；S2，利用EpCAM抗体和Vimentin抗体捕获所述白膜层细胞中的循环肿瘤细胞。2.根据权利要求1所述的捕获方法，其特征在于，所述S2具体包括中，向含有所述白膜层细胞的液体中加入EpCAM抗体和Vimentin抗体，孵育后，弃上清，重悬抗体细胞混合物加入链霉亲和素磁珠或亲和素磁珠孵育，与链霉亲和磁珠或亲和素磁珠结合的细胞为最终捕获到的循环肿瘤细胞。3.根据权利要求2所述的捕获方法，其特征在于，所述S2中：重悬抗体细胞混合物加入链霉亲和素磁珠孵育后还包括将磁珠抗体细胞混合物贴在磁力架上，待上清清澈后，将上清吸出，加入洗涤液混匀后再次贴在磁力架上，待上清清澈后，将上清吸出，重复操作多次，得到所述循环肿瘤细胞。4.根据权利要求2所述的捕获方法，其特征在于，在所述S1和S2之间还包括：去除所述白膜层细胞中的白细胞，得到第一上清液；所述第一上清液即为含有所述白膜层细胞的液体；优选的，利用CD45磁珠去除所述白膜层细胞中的白细胞。5.根据权利要求1所述的捕获方法，其特征在于，所述淋巴细胞分离液为Ficol...

【专利技术属性】
技术研发人员：骆靖华，王燕，刘霞，方楠，王建伟，伍启熹，刘倩，刘珂弟，唐宇，
申请(专利权)人：北京优迅医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11