猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用，检测试剂盒包括重组蛋白S1D。本发明专利技术还公开基于S1D蛋白检测鼻液和唾液中猪流行性腹泻病毒SIgA的间接ELISA方法，通过基因克隆表达技术成功构建重组质粒，蛋白纯化亲和层析技术获取猪流行性腹泻病毒S1D蛋白，以S1D蛋白为包被抗原建立间接ELISA检测黏液中猪流行性腹泻病毒SIgA抗体方法。可用于猪群中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体检测，判断猪群中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体水平。该方法具有较好的特异性和敏感性，可应用于猪流行性腹泻病毒SIgA抗体的临床检测及黏膜免疫评价。本发明专利技术操作简单，应用范围广。

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用
本专利技术属于兽医生物
，具体涉及猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用，本专利技术基于猪流行性腹泻病毒S1D蛋白为包被抗原，建立检测鼻液和唾液中猪流行性腹泻病毒SIgA抗体的间接ELISA方法。
技术介绍
猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的一种以猪水样腹泻、呕吐、脱水为特征的急性肠道传染病。该病对哺乳仔猪危害最大，呈现高发病率、高死亡率等特点，其他年龄段的猪也易感染，且可持续带毒。目前，PED在全世界广泛流行和迅速传播，给各国养猪业带来了巨大的经济损失。PEDV为冠状病毒，其病毒粒子共包含4个结构蛋白：纤突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)以及核衣壳蛋白(N)。其中S蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，病毒粒子可以通过S蛋白与细胞表面受体结合，借助细胞膜融合机制从而侵入宿主细胞，该蛋白还可以激发感染宿主产生中和抗体，在病毒的预防机制中发挥着重要的生物学作用。根据其不同部位的功能，分为具有识别结合宿主特异性受体位点的S1亚基(1～789aa)和介导病毒与宿主细胞膜融合的S2亚基(790～1383aa)。其中，S1亚基的S1D区(534-789aa)，携带了PEDV主要的B细胞抗原表位，能够给动物机体提供免疫保护作用。因此选取该区域基因构建表达载体，表达的蛋白可以作为良好的制备抗体检测试剂盒的备选包被抗原。PEDV主要通过消化道入侵并主要引起小肠发生病变。通过黏膜免疫可直接切断PEDV的主要入侵途径，有效防止PED的发生。黏膜免疫的主要效应因子是分泌型IgA(SecretoryimmunoglobulinA，SIgA)，主要存在于消化道，呼吸道以及生殖道黏液中，其具有多种生物学功能，如抑制病原体粘附、抗病毒感染、免疫清除等，尤其SIgA通过与病毒结合并能阻止病毒的入侵受到高度关注。SIgA已成为检测和判断黏膜免疫和抗病毒的重要指标。目前，口服免疫和鼻腔免疫(黏膜免疫)是预防PED的最佳免疫途径。但现在应用的检测主要针对血清IgG和乳汁IgA，少量检测肠道黏液IgA，而且所用的ELISA方法主要通过PEDV全病毒包被。至今还没有评价黏液中PEDV特异性抗体的标准，因此限制了黏膜免疫的应用。试验表明血清中IgG的抗体效价不能代表PEDV黏膜免疫水平，而乳汁的采集比较繁琐困难，且有一定的时间局限性；肠道黏液的采集需要处死动物，不利于活体检测，采集更为繁琐局限。相比之下，鼻液和唾液采集方便，无时间局限性，且不同黏膜处SIgA水平具有一定相关性。此外PEDV全病毒包被因其病毒的扩繁和纯化操作复杂，试验要求高、成本昂贵、耗时长产率低，不能被广泛应用，从而限制了PEDV抗体的检测。大肠杆菌原核表达系统简便，可广泛应用。因此，本专利技术建立了一种检测鼻液和唾液中PEDV特异性SIgA抗体水平的方法，从而评估猪群PEDV黏膜免疫力水平。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒。本专利技术还要解决的技术问题是提供了一种基于猪流行性腹泻病毒S1D蛋白建立的间接ELISA检测方法，可用于猪群中黏膜处猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体检测，以此判断猪群中特异性黏膜免疫水平。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案是猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包括重组蛋白S1D。其中，所述重组蛋白S1D是通过PCR方法从猪流行性腹泻病毒ZJ-08株全基因组扩增得到的S1D基因片段克隆到pET28a(+)中，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，然后表达纯化获得该重组蛋白。其中，所述PCR方法中的引物序列如下：F：5’-AGTGCGGCCGCAAGCTTACTAAAGTTGGTGGGAATACTAATATTCCCAGTAACC-3’，R：5’-AAATGGGTCGCGGATCCGGGTTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGAC-3’。其中，所述包被抗原重组蛋白S1D的浓度为0.5～4μg/mL。作为优选，包被抗原重组蛋白S1D的浓度为2μg/mL。其中，所述检测试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgA抗体、包被液、磷酸盐缓冲液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物显色液和终止液。其中，所述包被液的组成为：碳酸钠和碳酸氢钠加蒸馏水混合，调pH值到9.6。其中，所述磷酸盐缓冲液的组成为：氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钾和十二水合磷酸氢二钠，加蒸馏水混合，调pH值到7.4。其中，所述封闭液为PBS稀释的脱脂奶粉或PBS稀释的牛血清白蛋白。本
技术实现思路
还包括一种基于S1D蛋白检测鼻液和唾液中猪流行性腹泻病毒SIgA的间接ELISA方法，所述方法包括如下步骤：1)包被抗原重组蛋白S1D的制备；2)用碳酸盐缓冲液稀释包被抗原，包被96孔ELISA包被板，4℃条件下包被12-14小时后甩干，采用PBST洗涤3-4次，拍干；鼻拭子封闭采用PBS稀释的脱脂奶粉，口腔拭子封闭采用PBS稀释的牛血清白蛋白，37℃条件下封闭后甩干，用PBST洗涤3-4次，拍干；以PBS稀释的牛血清白蛋白作为样品稀释液进行稀释，37℃条件下孵育90min后甩干，用PBST洗涤3-4次，拍干；HRP标记羊抗猪IgA抗体用样品稀释液稀释，37℃条件下孵育后甩干，用PBST洗涤3-4次，每次5min，拍干；加入底物TMB显色液，37℃条件下作用7-15min后加硫酸终止液终止反应；采用酶标仪OD450nm吸光度下读取数据；3)利用以上ELISA方法检测PEDV阴性鼻拭子，口腔拭子样品，测定OD450nm值，计算阴性样品平均值和标准差(SD)，当待检样品OD450nm值即可判定为阳性，其他判定为阴性。具体地，针对鼻液：OD450nm＞0.1375判为阳性；OD450nm≤0.1375判为阴性；针对唾液：OD450nm＞0.1442判为阳性；OD450nm≤0.1442判为阴性。其中，所述鼻拭子稀释比例为1∶1，口腔拭子稀释比例为1∶2。有益效果：本专利技术相对于现有技术，具有以下优点：1、本专利技术建立了一种用于检测唾液和鼻液中猪流行性腹泻特异性SIgA抗体的ELISA检测试剂盒和检测方法，为检测预防猪流行性腹泻黏膜免疫的效果提供的一种简便方法。本专利技术中所用的包被抗原PEDVS1D蛋白是利用基因克隆PCR方法，扩增PEDVZJ-08株纤突S蛋白B细胞抗原表位区域S1D，将S1D基因插入大肠杆菌表达载体pET28a(+)中构建重组质粒pET28a(+)-S1D，再将该重组质粒转入大肠杆菌BL21中进行原核表达，经过变性、纯化、复性后而形成的抗原蛋白。2、本专利技术使用PEDVS1D蛋白作为包被抗原，一方面是由于是PEDVS蛋白B细胞抗原表位区域，在感染或免疫后第一时间机体能分泌针对其特异性抗体反应，从而可以为该病原的感染或免疫作检测；另一方面，该蛋白具有一定种属特异性，与其他病毒不存在血清学交叉干扰，从而可以保证该检测方法的特异性。3、本专利技术建立的ELISA检测试剂盒和检测方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括重组蛋白S1D。

【技术特征摘要】
1.猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括重组蛋白S1D。2.根据权利要求1所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白S1D是通过PCR方法从猪流行性腹泻病毒ZJ-08株全基因组扩增得到的S1D基因片段克隆到pET28a(+)中，然后转化至大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，并表达纯化获得该重组蛋白。3.根据权利要求2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PCR方法中的引物序列如下：F:5’-AGTGCGGCCGCAAGCTTACTAAAGTTGGTGGGAATACTAATATTCCCAGTAACC-3’，R:5’-AAATGGGTCGCGGATCCGGGTTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGAC-3’。4.根据权利要求1或2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述重组蛋白S1D的浓度为0.5~4μg/mL。5.根据权利要求1或2所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgA抗体、包被液、磷酸盐缓冲液、洗涤液、封闭液、稀释液、底物显色液和终止液。6.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述包被液的组成为：碳酸钠和碳酸氢钠加蒸馏水混合，调pH值到9.6。7.根据权利要求3所述的ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的组成为：氯化钠、磷酸二氢钾、氯化钾和十二...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩，王永恒，李昱辰，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32