鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法及试剂盒：提取样品中的DNA作为模板，采用通用引物进行PCR扩增；对扩增产物采用高分辨熔解仪器进一步熔解；通过分析高分辨熔解曲线的形状来鉴别样品中的动物源性成分。本发明专利技术采用通用引物扩增目的基因序列，不仅可以准确鉴别样品中的动物源性成分，而且相对于传统的多重PCR，克服了引物对之间相互竞争、PCR反应条件优化难度大等问题，检测效率显著提高。本发明专利技术具有操作简单、检测快、检测样品通量高、检测结果精准的优点，适用于乳制品以及其他食品中动物源性成分的掺假检测及溯源鉴定。

High Resolution Melting Method and Kit for Identification of Animal Origin Components

The invention discloses a high-resolution melting method and kit for identifying animal-derived components: extracting DNA from samples as template, using universal primers for PCR amplification, further melting the amplified products with high-resolution melting instrument, and identifying animal-derived components in samples by analyzing the shape of high-resolution melting curve. The method uses universal primers to amplify the target gene sequence, which not only can accurately identify the animal-derived components in the sample, but also overcomes the problems of competition between primer pairs and difficulty in optimizing the reaction conditions of the PCR, and greatly improves the detection efficiency compared with the traditional multiple PCR. The invention has the advantages of simple operation, fast detection, high sample flux and accurate detection results, and is suitable for adulteration detection and traceability identification of animal-derived ingredients in dairy products and other foods.

【技术实现步骤摘要】
鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学鉴定
，具体涉及一种用于乳制品等食品中动物源性成分鉴别的PCR高分辨熔解方法及试剂盒。
技术介绍
乳制品是人类健康膳食的主要营养来源，在蛋白质、矿物质、脂肪、维生素等方面含量及种类丰富，深受消费者喜爱，随着生活水平的提高，人们对乳制品的需求量不断提升，乳制品市场成为了一个很大的销售市场。在经济利益的驱使下，商家使用各种手段尽可能地缩减成本，掺假售假的现象层出不穷。主要的掺假行为有：在乳制品生产过程中，以次充好，制假造假，如在羊乳中混入营养价值和价格相对较低的其他动物乳或非乳原料，这种情况下，乳制品的品质已经无法保证，存在损害消费者健康的风险。因此，鉴别乳制品中的动物源性成分确有必要。目前应用于乳制品的掺假检测方法，主要以乳制品中两大生物分子的检测为方向，一种是依据蛋白质分子在结构、性质之间的差异性所建立的方法，涉及色谱、质谱、免疫、电泳等。但是色谱和质谱价格昂贵，无法普及，而免疫法特异性较低，电泳法耗时长，并且以上检测方法均因蛋白质受热容易变性，对于经过均质、杀菌等热处理的乳制品而言，检测效果并不理想，所以实用价值不高。另外一种是基于DNA差异建立的检测方法，尽管近年来专门提取DNA的试剂盒法应用的比较广泛，但目前基于DNA检测的方法也有一定的局限性。例如，琼脂糖凝胶电泳中PCR扩增产物易受污染，且速度较慢；荧光定量PCR中，探针设计比较复杂且成本比较高。最新应用的检测技术中，膜芯片法和液相芯片法都需要对PCR扩增产物进行杂交处理，存在污染的可能性，且无法判定掺假比例，只能确定某种动物源性成分的有无；基因条形码技术Sanger测序法，需要进一步测序，步骤多且耗时长。即以上检测方法存在耗时、不经济、检测结果不准确等问题。高分辨熔解曲线分析(HighResolutionMeltinganalysis,HRM)是一种荧光PCR检测技术，其主要原理是双链的熔解行为取决于GC含量、DNA双链的长度，以及碱基的互补性差异，通过在DNA熔解过程中实时检测饱和荧光染料信号改变获得熔解曲线，实现样品差异的分析。这种分析方法，是一种闭管技术，由于使用了针对该方法所开发的饱和染料，出现非特异性扩增和抑制PCR扩增的可能性很少，结合采用的更加精密的分析仪器和软件，数据收集和分析更加全面，将其用于乳制品中动物源性成分的鉴定，可以实现关系密切物种间的精准鉴别。由于乳制品等食品中的动物源性成分所含线粒体DNA在经历高温、高压或化学处理等加工过程后，性质依旧稳定，以及具有种属特异性，所以更为适合用于分析动物源性成分的组成。但目前尚无利用通用引物进行高分辨熔解曲线分析并实现快速、经济、准确分析和鉴别动物源性成分的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法及试剂盒，本专利技术基于PCR高分辨熔解的方法，用以快速、经济、准确地鉴别乳制品等食品中的动物源性成分。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，包括以下步骤：1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，利用物种间在某段基因组DNA上的序列保守性和特异性选取或设计通用引物；2)对通用引物进行扩增及扩增产物熔解的特异性检验；3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的通用引物进行PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，根据高分辨熔解曲线的位置、形状、差异化图的特征中的任意一种或多种鉴别样品中的动物源性成分的构成情况。优选的，所述样品采集自乳制品或生乳。优选的，所述动物种类包括山羊、绵羊、牛、水牛中的两种以上。优选的，所述PCR扩增采用的反应体系包括DNA模板、通用引物、PCR反应试剂(例如，2×TapPCRMasterMix)、双蒸水以及荧光染料。优选的，所述PCR扩增采用的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃再延伸5min。优选的，所述高分辨熔解的程序为：在闭管条件下，PCR扩增的产物的熔解温度从65℃以0.05℃/s逐渐升温到95℃，从65℃开始收集荧光信号。优选的，所述步骤3)中，将样品对应的高分辨熔解曲线与对照品(采用通用引物进行PCR扩增后)对应的高分辨熔解曲线进行二维或三维主成分分析，根据分析结果确定样品与不同对照品所对应的高分辨熔解曲线的区分度，依据区分度确定样品中动物源性成分的构成(参考与样品区分度低，或者说，与样品分析得到的主成分属于相同的一类的对照品)，所述对照品选自不同动物源性成分各自的基因组DNA或相应不同基因组DNA的任意组合。优选的，经过步骤3)后或直接对于确定含有两种动物源性成分的样品，对该样品对应的高分辨熔解曲线进行二维主成分分析，然后根据主成分-混合比例标准回归方程计算得到所述样品中两种动物源性成分的比例。优选的，所述标准回归方程是通过将两种动物源性成分各自对应的基因组DNA及两种动物源性成分对应的基因组DNA不同比例的混合物分别作为模板进行PCR扩增及高分辨熔解，并将各扩增产物的高分辨熔解曲线经二维主成分分析所得到的主成分的横坐标与对应的动物源性成分混合比例进行线性回归分析而得到的。一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解试剂盒，包括上述通用引物、PCR反应试剂、双蒸水、荧光染料、标准回归方程以及对照品对应的高分辨熔解曲线。优选的，试剂盒还包括不同动物源性成分的基因组DNA。本专利技术的有益效果体现在：本专利技术采用基于通用引物PCR高分辨熔解方法，通过分析高分辨熔解曲线的形状等特征来鉴别样品中的动物源性成分，保证了检测结果的可重复性，提高了检测的灵敏度，具有操作简单、检测快速、检测样品通量高、检测结果精准的优点，适用于乳制品等含有动物源性成分的食品的掺假检测及溯源鉴定。本专利技术采用通用引物扩增目标DNA，不仅可以准确鉴别乳制品等食品中的动物源性成分，而且相对于传统的多重PCR，克服了引物对之间相互竞争、PCR反应条件优化难度大等问题，检测效率显著提高。进一步的，本专利技术利用标准回归方程，可以快速、准确的得到某动物源性乳制品中掺入的另一种动物源性成分的比例。附图说明图1为山羊、绵羊、牛、水牛扩增目的基因序列选取及比对图；图2为可行性分析结果图；其中：(a)理论拟合的山羊、绵羊、牛、水牛高分辨熔解曲线，(b)实验得到的山羊、绵羊、牛、水牛高分辨熔解曲线，(c)不同物种的扩增曲线和琼脂糖凝胶电泳图，(d)不同物种的熔解峰图；图3为15种不同组分检测结果图；其中：(a)高分辨熔解曲线，(b)差异化图，(c)二维主成分分析图，(d)三维主成分分析图；图4为不同掺假比例检测结果图；其中：(a)不同掺假比例的牛和水牛样品主成分分析图，(b)不同掺假比例的牛和水牛样品标准曲线，(c)不同掺假比例的牛和山羊样品主成分分析图，(d)不同掺假比例的牛和山羊样品标准曲线；图中：英文字母G、S、B、W、D、H、C、R、Du、Do、F、P、NTC依次代表山羊、绵羊、牛、水牛、驴、马、鸡、兔、鸭、鸽子、鱼、猪、空白(双蒸水)。电泳泳道M代表Marker，泳道1-10分别代表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，利用物种间在某段基因组DNA上的序列保守性和特异性选取或设计通用引物；2)对通用引物进行扩增及扩增产物熔解的特异性检验；3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的通用引物进行PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，根据高分辨熔解曲线的位置、形状、差异化图的特征中的任意一种或多种鉴别样品中的动物源性成分的构成情况。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：包括以下步骤：1)根据样品中的不同动物源性成分的可能掺入情况，确定需要鉴别的各动物源性成分所对应的动物种类，根据确定的动物种类，利用物种间在某段基因组DNA上的序列保守性和特异性选取或设计通用引物；2)对通用引物进行扩增及扩增产物熔解的特异性检验；3)以提取自所述样品中的DNA为模板，利用经过检验确定的通用引物进行PCR扩增，对扩增得到的产物进行高分辨熔解并获取高分辨熔解曲线，根据高分辨熔解曲线的位置、形状、差异化图的特征中的任意一种或多种鉴别样品中的动物源性成分的构成情况。2.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：所述样品采集自乳制品或生乳。3.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：所述动物种类包括山羊、绵羊、牛、水牛中的两种以上。4.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的反应体系包括DNA模板、通用引物、PCR反应试剂以及荧光染料。5.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：所述高分辨熔解的程序为：将PCR扩增的产物在闭管条件下从65℃开始逐渐升温到95℃，并收集荧光信号。6.根据权利要求1所述一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：所述步骤3)中，将样品对应的高分辨熔解曲线与对照品对应的高分辨熔解曲线进行二维或三维主成分分析，根据分析结果确定样品与不同对照品所对应的高分辨熔解曲线的区分度，依据区分度确定样品中动物源性成分的构成，所述对照品选自不同动物源性成分各自的基因组DNA或相应不同基因组DNA的任意组合。7.根据权利要求1或6所述一种鉴别动物源性成分的高分辨熔解方法，其特征在于：经过步骤3)后，对于确定含有两种动物源性成分的样品，对该样品对应的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐秦峰，贺晓玲，马西亚，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61