一种叶酸-Pluronic F127修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种叶酸‑Pluronic F127修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法，是以磷脂、胆固醇、叶酸‑Pluronic F127和姜黄素为原料，采用薄膜分散法结合动态高压微射流技术，经溶解、成膜、水化及动态高压微射流等处理制备的叶酸‑Pluronic F127修饰姜黄素纳米脂质体。本方法制备的叶酸‑Pluronic F127修饰姜黄素纳米脂质体的平均粒径为85.4±2.7nm，分散系数为0.388±0.015，姜黄素包封率为87.8±2.4％。本发明专利技术制备的叶酸‑Pluronic F127修饰姜黄素纳米脂质体具有良好的缓释性，在pH7.4条件下，经72h后有78.3％的姜黄素释放出来，且叶酸修饰可增强姜黄素脂质体的细胞毒性。

Preparation of curcumin nanoliposomes modified by folic acid-Pluronic F127

The invention belongs to the field of biomedicine, in particular to a preparation method of curcumin nano-liposomes modified by folic acid Pluronic F127, which is prepared from phospholipids, cholesterol, folic acid Pluronic F127 and curcumin by membrane dispersion method combined with dynamic high-pressure micro-jet technology and treated by dissolution, film formation, hydration and dynamic high-pressure micro-jet. Modified curcumin nanoliposomes. The average particle size of curcumin nanoliposomes modified by folic acid Pluronic F127 was 85.4 (+2.7nm), the dispersion coefficient was 0.388 (+0.015), and the encapsulation efficiency of curcumin was 87.8 (+2.4). The curcumin nano-liposomes modified by folic acid Pluronic F127 have good sustained-release property, and 78.3% curcumin is released after 72 hours at pH 7.4, and the cytotoxicity of curcumin liposomes can be enhanced by folic acid modification.

【技术实现步骤摘要】
一种叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法。
技术介绍
姜黄素是一种从姜科姜黄属植物的根茎中提出的一种多酚类植物化学物，它属于天然抗氧化剂，具有抗肿瘤、改善心血管功能、抗炎、抗病毒、保肝、增强免疫力等作用。但是在实际应用过程中，姜黄素存在水溶性差、稳定性差、口服生物利用率低、以及体内易被代谢等缺陷。随着包埋技术的发展，采用脂质体、纳米粒子、胶囊、胶束、乳液等技术来包埋姜黄素，可提高姜黄素的生物利用率和扩大其使用范围。脂质体是由双亲性物质如磷脂组成的内部为水相、具有类细胞膜结构的双分子层闭合囊泡。可以运载亲水性和亲脂性的物质，在生物医药、食品营养、化妆品等领域有广泛的应用。PluronicF127嵌段共聚物是一种已经商业化的产品，具有很好的生物相容性，PluronicF127已经被美国食品与药物管理局(FDA)批准使用。叶酸是人体所需的B族维生素，叶酸(FA)与肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体(FolateReceptor,FR)与受体亲和力高，因此叶酸受体介导的靶向治疗已成为国内外研究的热点。本专利技术以叶酸-PluronicF127为修饰剂，采用薄膜分散法结合动态高压微射流技术制备叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体，该法制备的叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体具有良好的缓释性能，且增强了姜黄素的细胞毒性。专利技术CN201510671604.3一种叶酸-壳聚糖修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法也公开了姜黄素纳米脂质体的制备方法，其制备方法与本专利技术不同，本专利技术通过采用脱水缩合的方法将叶酸连接在PluronicF127的一端，效果侧重也与本专利技术不同，CN201510671604.3主要是侧重于提高修饰后的缓释特性，而本专利技术的主要是增强其对KB细胞的细胞毒性。
技术实现思路
本专利技术目的是为了针对现有姜黄素脂质体的水溶性差、稳定性差、口服生物利用率低、以及体内易被代谢等不足，提供一种叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法，以提高姜黄素的细胞毒性，评价其缓释性能，促进叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的开发。本专利技术的具体工艺步骤如下：A:叶酸-PluronicF127的合成(1)取叶酸(0.836g,1.9mmol)与1,3－二环己基碳二亚胺(0.367g,1.75mmol)于圆底烧瓶中，加入35mL经干燥的二甲基亚砜进行溶解，于室温下搅拌24h；(2)将干燥后的F127(20g,1.60mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.196g,1.60mmol)加入步骤(1)的圆底烧瓶中，继续于室温下搅拌48h；(3)将步骤(2)所得的溶液于5000rpm离心5min,取上清液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，在DMSO环境中透析6h，以除去混合液中未反应的FA，继续用超纯水透析48h以除去溶液中的DMSO；(4)将步骤(3)所得的透析液用旋转蒸发仪旋干除水后于真空下干燥，最后将干燥的产物用CH2Cl2溶解，于冰乙醚中沉淀两次，收集沉淀于真空干燥箱中干燥24h,干燥后的产物即FA-F127；B：薄膜分散法结合动态高压微射流技术制备叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体(1)各原料的质量比为磷脂：胆固醇：FA-F127：姜黄素为20:4:10:1；(2)按上述质量比称取磷脂、胆固醇和FA-F127和姜黄素，在50℃温度下，用20mL无水乙醇完全溶解各组分；(3)将步骤2中的溶液于旋转蒸发仪上旋蒸除去无水乙醇，各组形成均匀薄膜，其中水浴温度为45℃；(4)按2％的磷脂浓度加入纯水进行水化洗膜30min，水浴温度为45℃，形成粗脂质体悬液；(5)采用动态高压微射流处理步骤(4)中的粗脂质体悬液2次，操作压力为120MPa，即得叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体。本专利技术的有益效果：(1)制备的叶酸-PluronicF127修饰的姜黄素脂质体(cur-FA-F127-Lps)平均粒径为85.4±2.7nm，分散系数为0.388±0.015，姜黄素的包封率高达87.8±2.4％，其微观结构为球形，且分散均匀，在pH7.4的环境下具有良好的缓释行为；(2)采用人口腔表皮样癌KB细胞进行细胞毒性(MTT)实验后发现，cur-FA-F127-Lps经48h和72h的细胞培养后，KB细胞存活率明显高于PluronicF127修饰的姜黄素脂质体。附图说明图1为叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的工艺路线图；图2为叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的粒径分布图；图3为叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的透射电镜图；图4为叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的释放行为图图5为叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的细胞毒性。具体实施方式实施例11、准确称取FA(0.835g,1.9mmol)、DCC(0.361g,0.75mmol)于250mL圆底烧瓶中，加入35mL经干燥的DMSO进行溶解，于室温下搅拌24h。将干燥后的F127(20.1g,1.60mmol)和DMAP(0.195g,1.60mmol)加入烧瓶中，继续于室温下搅拌48h。将反应后的产物于5000rpm离心5min,取上清液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，在DMSO环境中透析6h，以除去混合液中未反应的FA。继续用超纯水透析48h以除去溶液中的DMSO。将透析液用旋转蒸发仪旋干除水后于真空下干燥，最后将干燥的产物用CH2Cl2溶解，于冰乙醚中沉淀两次。收集沉淀于真空干燥箱中干燥24h,干燥后的产物即FA-F127。2、将磷脂、胆固醇、FA-F127和姜黄素(质量比为20:4:10:1)混合于少量无水乙醇中溶解,将溶解后的混合溶液置于旋转蒸发仪中，于45℃水浴除去乙醇，形成脂质薄膜。加入超纯水于45℃条件下水化30min，将溶液用DHPM于120MPa条件下处理2次，即得到cur-FA-F127-Lps。3、粒径及分散性考察：用激光纳米粒度仪测定其平均粒径和分散系数。结果显示cur-FA-F127-Lps的平均粒径为85.4±2.7nm，分散系数为0.388±0.015，结果如说明书附图2所示。4、姜黄素包封率的测定：将cur-FA-F127-Lps于8000rpm下离心10min，取上清液用无水乙醇稀释20倍，用紫外分光光度计于420nm测定吸光度，根据姜黄素乙醇标准曲线计算姜黄素的包封率。结果表明姜黄素的包封率高达87.8±2.4％。5、微观形态观察：采用透射电镜(TEM)观察cur-FA-F127-Lps的微观形态。测定步骤如下：在封口膜上滴一滴cur-FA-F127-Lps溶液，将铜网置于液滴中3min后取出，用滤纸从边缘吸去溶液，再置于1％磷钨酸钠溶液负染色2min后取出，用滤纸从边缘吸去溶液，于室温下晾干，在TEM下进行观察。由电镜照片可知，cur-FA-F127-Lps呈球形，大小均一。结果如说明书附图3所示。6、缓释行为：在体外模拟生物体内环境(pH7.4)条件下，cu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种叶酸‑Pluronic F127修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：A:叶酸‑Pluronic F127的合成(1)取叶酸(0.836g,1.9mmol)与1,3－二环己基碳二亚胺(0.367g,1.75mmol)于圆底烧瓶中，加入35mL经干燥的二甲基亚砜进行溶解，于室温下搅拌24h；(2)将干燥后的F127(20g,1.60mmol)和4‑二甲氨基吡啶(0.196g,1.60mmol)加入步骤(1)的圆底烧瓶中，继续于室温下搅拌48h；(3)将步骤(2)所得的溶液于5000rpm离心5min,取上清液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，在DMSO环境中透析6h，以除去混合液中未反应的FA，继续用超纯水透析48h以除去溶液中的DMSO；(4)将步骤(3)所得的透析液用旋转蒸发仪旋干除水后于真空下干燥，最后将干燥的产物用CH2Cl2溶解，于冰乙醚中沉淀两次，收集沉淀于真空干燥箱中干燥24h,干燥后的产物即FA‑F127；B：薄膜分散法结合动态高压微射流技术制备叶酸‑Pluronic F127修饰姜黄素纳米脂质体(1)各原料的质量比为磷脂：胆固醇：FA‑F127：姜黄素为20:4:10:1；(2)按上述质量比称取磷脂、胆固醇和FA‑F127和姜黄素，在50℃温度下，用20mL无水乙醇完全溶解各组分；(3)将步骤2中的溶液于旋转蒸发仪上旋蒸除去无水乙醇，各组形成均匀薄膜，其中水浴温度为45℃；(4)按2％的磷脂浓度加入纯水进行水化洗膜30min，水浴温度为45℃，形成粗脂质体悬液；(5)采用动态高压微射流处理步骤(4)中的粗脂质体悬液2次，操作压力为120MPa，即得叶酸‑Pluronic F127修饰姜黄素纳米脂质体。...

【技术特征摘要】
1.一种叶酸-PluronicF127修饰姜黄素纳米脂质体的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：A:叶酸-PluronicF127的合成(1)取叶酸(0.836g,1.9mmol)与1,3－二环己基碳二亚胺(0.367g,1.75mmol)于圆底烧瓶中，加入35mL经干燥的二甲基亚砜进行溶解，于室温下搅拌24h；(2)将干燥后的F127(20g,1.60mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.196g,1.60mmol)加入步骤(1)的圆底烧瓶中，继续于室温下搅拌48h；(3)将步骤(2)所得的溶液于5000rpm离心5min,取上清液装入截留分子量为3500Da的透析袋中，在DMSO环境中透析6h，以除去混合液中未反应的FA，继续用超纯水透析48h以除去溶液中的DMSO；(4)将步骤(3)所得的透析液用旋转蒸发仪旋干除水后...

【专利技术属性】
技术研发人员：李资玲，熊向源，吴光杰，龚妍春，
申请(专利权)人：江西科技师范大学，
类型：发明
国别省市：江西,36