柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用，并具体公开了一种密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因，其特征在于，包括SEQ ID NO:2所示的序列。本发明专利技术通过抑菌蛋白CsLTP3密码子优化，原核表达载体构建，rCsLTP3的重组表达、纯化及鉴定，得到的rCsLTP3蛋白具备较好的热稳定性、酸碱稳定性，而且在活体条件下，对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌具有明显的抑制效果，与现有技术相对，本发明专利技术中的植物源抑菌蛋白CsLTP3是一种能够大规模生产的天然抑菌剂，能够显著降低柑橘果实采后绿霉病的发生，且减少化学杀菌剂造成的危害，在柑橘果实防腐保鲜领域具有良好的应用前景。

Preparation and application of Citrus natural bacteriostatic protein CsLTP3

The invention discloses the preparation and application of Citrus natural bacteriostatic protein CsLTP3, and specifically discloses a codon-optimized non-specific lipid transfer protein CsLTP3 gene in Rutaceae plants, including the sequence shown in SEQ ID NO:2. By optimizing the codon of CsLTP3, constructing prokaryotic expression vector, recombinant expression, purification and identification of rCsLTP3, the obtained rCsLTP3 protein has good thermal stability and acid-base stability, and has obvious inhibitory effect on Penicillium digitatum, the pathogen of Postharvest chloromycosis of Citrus in vivo. Compared with the existing technology, the plant-derived inhibitory effect of the present invention is better. Mycoprotein CsLTP3 is a natural bacteriostat which can be produced on a large scale. It can significantly reduce the occurrence of Postharvest Green Mold in citrus fruits and reduce the harm caused by chemical fungicides. It has a good application prospect in the field of preservation and freshness preservation of citrus fruits.

【技术实现步骤摘要】
柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用
本专利技术属于柑橘采后绿霉病防治领域，更具体地，涉及一种柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用，可应用于防治芸香科植物果实(如柑橘)采后绿霉病，即利用基因工程制备柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3的方法以及利用该方法制备的提取物作为植物源抑菌剂在诸如柑橘采后病害绿霉病防治中的应用。
技术介绍
柑橘是全球第一大水果，在其采收、运输及贮藏期间，因措施不当导致果实损伤，易遭受多种病原菌的侵染产生采后病害，导致果实腐烂变质，给柑橘产业带来巨大经济损失[1]。由指状青霉(PenicilliumDigitatum)和意大利青霉(PenicilliumItalicum)引起的柑橘绿霉病和青霉病是柑橘采后的两大主要病害，导致的腐烂率为70％～80％[2-3]，其中以指状青霉引起的腐烂尤为严重[4]。这种柑橘采后病害主要表现为，果实上病部先发软，呈水渍状，2-3天后产生白霉状物(病原菌的菌丝体)，后中央出现绿色粉状霉层(病原菌的子实体)，嗅之有闷人的芳香味，很快全果腐烂，果肉发苦，不堪食用。目前控制柑橘采后病害及贮藏保鲜的方法主要是采用化学杀菌剂(如苯并咪唑类、咪唑类、抑霉唑、双胍盐类等)结合物理贮藏技术(如低温、热处理等)处理果实[5]。虽然化学杀菌剂对柑橘采后病害有一定的控制作用，但其毒性大、环境污染严重，给人类健康带来严重威胁，许多化学杀菌剂的使用在很多国家遭到限制。而且由于这些药剂长期使用使致病菌产生抗药性，导致采后病害控制方法更加复杂化，影响保鲜效果。因此，寻找一种具有抑制柑橘病原菌活性的植物天然活性物质来控制柑橘采后病害对柑橘产业的发展具有重大意义。抗菌肽(antimicrobialpeptides，AMPs)因具有广谱的抗细菌活性，高效的抗真菌、病毒和原虫的活性；热稳定性好；抗菌机理独特，不易产生抗药性等特性，正引起人们的关注，有望成为替代抗生素的产品之一。研究发现抗菌肽广泛存在于原核生物、植物及动物体内，并在生物的天然防御系统中起着重要的作用。抗菌肽包括抗细菌多肽(antibacterialpeptides)和抗真菌多肽(antifungalpeptides)[6]。目前，国内对植物源抗菌肽的研究相对较少。有研究报道非特异性脂质转运蛋白(Non-specificlipidtransferprotein,nsLTP)具备广泛的抗真菌功能[7]。但未见直接采用非特异性脂质转运蛋白这类抗菌肽作为植物源抑菌剂在果蔬采后病害防控方面的研发应用报道。参考文献：[1]BrownGE,ChambersM.EvaluationofbiologicalproductsforthecontrolofpostharvestdiseasesofFloridacitrus[C]//Proc.Fla.StateHort.Soc.1996,109:278-282.[2]DemirciF.Effectsof'Pseudomonasfluorescens'and'Candidafamata'onBlueMouldofCitrusCausedby'PenicilliumItalicum'[J].AustralianJournalofCropScience,2011,5(3):344.[3]何天富.柑橘学[M].北京:中国农业出版社,1997:714-734.[4]MacarisinD,CohenL,EickA,etal.Penicilliumdigitatumsuppressesproductionofhydrogenperoxideinhosttissueduringinfectionofcitrusfruit[J].Phytopathology,2007,97(11):1491-1500.[5]SayagoJE,RM,KovacevichLN,etal.AntifungalactivityofextractsofextremophileplantsfromtheArgentinePunatocontrolcitruspostharvestpathogensandgreenmold[J].Postharvestbiologyandtechnology,2012,67:19-24.[6]deSouzaE,SousaDA,VianaJC,etal.Theuseofversatileplantantimicrobialpeptidesinagribusinessandhumanhealth[J].Peptides,2014,55:65-78.[7]KirubakaranSI,BegumSM,UlaganathanK,etal.Characterizationofanewantifungallipidtransferproteinfromwheat[J].PlantphysiologyandBiochemistry,2008,46(10):918-927.
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术的目的在于提供一种柑橘天然抑菌蛋白CsLTP3制备及其应用，抑菌蛋白CsLTP3可作为植物源抑菌剂应用于防治芸香科植物果实(如柑橘)采后绿霉病，其中通过抑菌蛋白CsLTP3密码子优化，原核表达载体构建，CsLTP3的重组表达、纯化及鉴定，得到的rCsLTP3蛋白具备较好的热稳定性、酸碱稳定性，而且在活体条件下，对柑橘采后绿霉病病原菌指状青霉菌(Penicilliumdigitatum)具有明显的抑制效果。与现有技术相对，本专利技术中的植物源抑菌蛋白CsLTP3是一种能够大规模生产的天然抑菌剂，能够显著降低柑橘果实采后绿霉病的发生，且减少化学杀菌剂造成的危害，在柑橘果实防腐保鲜领域具有良好的应用前景。为实现上述目的，按照本专利技术的一个方面，提供了一种密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因，其特征在于，包括SEQIDNO:2所示的序列。按照本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一种用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物包括SEQIDNO:3所示的序列；所述反向引物包括SEQIDNO:4所示的序列。按照本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一种rCsLTP3重组蛋白，其特征在于，该蛋白为：i.由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或ii.与SEQIDNo.1所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；或iii.SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。按照本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一种诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.01～1mmol/LIPTG，在12～37℃诱导4～24h后，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白；优选的，是将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.1mmol/LIPTG，在20℃诱导16h后，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白；其中，所述重组菌为转入CsLTP3基因原核表达载体的大肠杆菌；所述CsLTP3基因原核表达载体具体是以如权利要求1所述密码子优化的芸香科植本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因，其特征在于，包括SEQ ID NO:2所示的序列。

【技术特征摘要】
1.一种密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因，其特征在于，包括SEQIDNO:2所示的序列。2.一种用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物包括SEQIDNO:3所示的序列；所述反向引物包括SEQIDNO:4所示的序列。3.一种rCsLTP3重组蛋白，其特征在于，该蛋白为：i.由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或ii.与SEQIDNo.1所限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列组成的蛋白质；或iii.SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的衍生蛋白。4.一种诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.01～1mmol/LIPTG，在12～37℃诱导4～24h后，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白；优选的，是将重组菌在对数生长期时加入终浓度为0.1mmol/LIPTG，在20℃诱导16h后，即诱导生成rCsLTP3重组蛋白；其中，所述重组菌为转入CsLTP3基因原核表达载体的大肠杆菌；所述CsLTP3基因原核表达载体具体是以如权利要求1所述密码子优化的芸香科植物中非特异性脂转移蛋白CsLTP3基因为模板，并利用如权利要求2所述用于构建CsLTP3基因原核表达载体的引物经PCR反应构建得到的。5.如权利要求4所述诱导表达rCsLTP3重组蛋白的方法，其特征在于，生成的所述rCsLTP3重组蛋白还经过纯化处理，所述纯化处理具体是先收集诱导后的重组菌，然后对这些重组菌进行PBS洗涤、离心、重悬于冰预冷的裂解缓冲液、以及超声破菌处理，然后离心收集上清，接着用滤膜过滤该上清，得到的滤液经HIS镍柱纯化体系纯化洗脱处理后收集洗脱液即得到rCsLTP3重组蛋白。6.一种鉴定rCsLTP3重组蛋白的方法，该方法是将待鉴定蛋白与CsLTP3蛋白经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定，若从所述待鉴定蛋白上鉴定出能够匹配CsLTP3蛋白的6个有效特异性肽段，则该待鉴定蛋白属于rCsLTP3重组蛋白；否则，该待鉴定蛋白不属于rCsLTP3重组蛋白；其中，所述CsLTP3蛋白具有如SEQIDNO:1所示的序列。7.一种检测如权利要求3所述rCsLTP3重组蛋白热稳定性或酸碱稳定性的方法，其特征在于，将rCsLTP3重组蛋白置于不超过120℃的温度条件下0-15m...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓秀新，马兆成，程运江，吴金龙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42