一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供了一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用，所述DPO引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明专利技术的DPO引物对可以特异性扩增念珠菌属，不与其他常见致病菌属如曲霉菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌发生交叉，此外，本发明专利技术DPO引物对的设计使得不同念珠菌种的产物具有不同退火温度，通过产物的熔解曲线分析，即可判定是白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌或光滑念珠菌中的哪种，仅用一对引物即可实现多重检测，较现有技术更为简便经济。

A DPO Primer Pair, Detection Method, Kit and Its Application for Candida Speciation Detection

The invention provides a DPO primer pair, a detection method, a kit and its application for Candida species detection. The nucleotide sequence of the DPO primer pair is shown in SEQ ID NO.1 2. The DPO primer pair of the invention can specifically amplify the genus Candida without crossing with other common pathogenic bacteria such as Aspergillus, Escherichia coli and Staphylococcus aureus. In addition, the DPO primer pair of the invention is designed to make the products of different Candida species have different annealing temperatures. By analyzing the melting curve of the products, it can be determined that the products are Candida albicans, Candida tropicalis and Near-flat. The multiple detection of Candida slidea, Candida krusei or Candida glabrata can be realized with only one pair of primers, which is simpler and more economical than the existing technology.

【技术实现步骤摘要】
一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用，尤其涉及一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用，具体涉及一种白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
念珠菌是真菌中最为常见的条件致病菌之一，主要包括白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌，所述念珠菌占临床医学样本中的80％以上。念珠菌常寄生于人的皮肤、口腔、阴道和肠粘膜等位置，当机体免疫机能下降时，容易引起念珠菌病。由于培养法区分不同念珠菌种的时间周期较长，不利于快速治疗，临床常用广谱抗真菌药物进行念珠菌感染的治疗。不同念珠菌种对抗生素的耐药性不同，若不区分菌种而采用统一的治疗方案容易对机体产生不同的影响。现有技术中常使用聚合酶链式反应(PCR)进行分种检测。CN109055502A公开了一种基于真菌游离DNA(cellfreeDNA,cfDNA)的侵袭性真菌感染快速多重PCR鉴定诊断检测方法，可鉴定由临床常见和高发的白色念珠菌(Candidaalbicans)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)，克柔念珠菌(Candidakrusei)，光滑念珠菌(Candidaglabrata)及烟曲霉(Aspergillusfumigtus)造成的侵袭性感染。该专利技术根据各真菌属、种的特征基因组区段设计扩增引物，依据所述扩增片段设计可区分菌种的检测荧光探针，对待测样品进行实时荧光PCR(realtimePCR)，综合了巢式PCR的高灵敏性和多重荧光杂交探针PCR的高特异性和多靶标性的优势鉴定真菌菌种。虽然该方法实现一步单管反应鉴定多种病原菌，但该反应体系中存在多条引物和探针，不仅经济成本高，反应体系的稳定性也显著降低。CN101509037A公开了一种检测四种/四种以上侵袭性念珠菌的快速诊断试剂盒及其应用方法，在试剂盒内设有含有特异性引物和至少四种念珠菌相对应的荧光探针的荧光定量PCR反应液、至少四种念珠菌的阳性质控品和阴性质控品，根据荧光定量PCR检测仪检测的Ct值进行判断。通过引物高特异扩增和荧光探针的高特异杂交双重控制，假阳性低。但该方法需要一对通用引物和针对不同菌种的特异性探针，探针数量多，反应体系稳定性较差，同时成本高昂。CN108034745A公开了一种检测四种念珠菌的引物探针组合，属于微生物检测
，包括引物和探针，所述引物为上游引物和下游引物；所述探针为标记有报告荧光基团和淬灭荧光基团的序列。该专利技术提供的一对引物一条探针特异性地同时检测白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌四种念珠菌。但该专利技术无法区分阳性样本对应的具体菌种，即无法对念珠菌进行分种。因此，提供一种特异性好、高效快速、成本低、灵敏度高、能区分不同念珠菌种的方法，具有重要意义，为精准用药、流行性疾病研究奠定基础。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种念珠菌分种检测的DPO引物对、检测方法、试剂盒及其应用，有效区分白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和光滑念珠菌，本专利技术的DPO引物对特异性好、灵敏度高，反应结束后利用熔解曲线判断待测样本所含念珠菌的菌种信息，高效简便，为精准用药和流行性疾病研究奠定基础。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种念珠菌分种检测的DPO引物对，所述DPO引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。DPO上游引物序列(SEQIDNO.1)：5’-ACAAGGTTTCCGTAGGTGIIIIIGCGGAAGGAT-3’；DPO下游引物序列(SEQIDNO.2)：5’-TCATATTACGTATCGCIIIIIICTGCGTTCTTC-3’.DPO(Dualprimingoligonucleotide)引物是一种双启动寡核苷酸引物，包括两个独立的特异性引物区域，这两段独立的特异性区域通过寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，使5’和3’区域形成两个独立功能的双特异性引物结构。本专利技术提供一种基于熔解曲线分析的侵袭性念珠菌DPO引物检测方法，用ClustaX比对NCBI上大量核酸序列，比对菌种范围包括：白色念珠菌LC016565.1、HE860439.1、HE860438.1、LC201976.1、HG916992.1等430条序列；近平滑念珠菌AB109223.1、LT596112.1、LN864561.1、FM172980.1、LC390002.1等800条序列；热带念珠菌KX664485.1、LT837798.1、JN542555.1、HM222942.1、FJ515173.1等350条序列；克柔念珠菌KU987874.1、KP674518.1、KX912139.1、FJ515204.1、EF568018.1等177条序列；光滑念珠菌HE993756.1、KU936094.1、KP780450.1、KM603625.1、LC011411.1、HG970737.1等291条序列。通过比对2048条序列，可以最大程度获得念珠菌种内高保守区，得到不同临床分离株的高保守区和可变区，进而指导引物设计位置，提高对不同菌种的不同分离株的敏感性；另一方面，通过不同菌种间的序列比对，可以明确不同菌种间的高突变区和高保守区，提高DPO引物对不同念珠菌菌种的特异性。为保证引物设计的通用性，需要在保守序列区设计引物，以使得设计的引物序列在面对绝大多数临床样本中的念珠菌种可以高效准确的扩增。但在设计引物的保守区出现的个别突变位点，设计的普通引物很难避免将该突变位点引入到引物中，会导致该引物在对存在该突变位点的临床分离株无法扩增(或者扩增效率大大下降)的情况出现，而通过多重序列分析，找出突变位点并利用DPO引物跨过该位点时，能够大大改善这种情况，提高引物体系的扩增效率和整套检测体系的敏感性。具体的引物设计包括如下步骤：(1)多重序列比对确定目标序列的高保守区18srRNA-ITS1-5.8srRNA-28srRNA序列比对，发现在念珠菌的18srRNA-ITS1-5.8srRNA-28srRNA(NC_032096.1:1891236-1893022)300-435bp区段出现了半保守区，436bp后为高保守区，序列比对的结果示意图见图1；(2)设计DPO引物利用18srRNA-ITS1-5.8srRNA-28srRNA区域，18s、5.8s、28srRNA突变少，而ITS1和ITS2区域种间突变较多的特点。在18s、5.8s、28srRNA区域上跨ITS去设计引物，使得引物位于突变少的18s、5.8s、28srRNA区，以保证不同念珠菌的正常扩增及效率，而不同念珠菌种间的ITS区域的突变和差异使得相同DPO引物对扩增得到的不同产物具有不同的退火温度Tm值，因此可以通过熔解曲线分析得以分析和确定，DPO引物设计示意图见图2，其中DPO引物中脱氧次黄嘌呤跨过目标序列的可变位点如图3所示。图3中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种念珠菌分种检测的DPO引物对，其特征在于，所述DPO引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。

【技术特征摘要】
1.一种念珠菌分种检测的DPO引物对，其特征在于，所述DPO引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1-2所示。2.一种如权利要求1所述的DPO引物对在制备念珠菌分种检测的产品中的应用。3.一种念珠菌分种检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的DPO引物对。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控、阳性质控和辅助试剂；优选地，所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；优选地，所述阳性质控分别为含有白色念珠菌DNA片段的质粒、含有热带念珠菌DNA片段的质粒、含有近平滑念珠菌DNA片段的质粒、含有克柔念珠菌DNA片段的质粒和含有光滑念珠菌DNA片段的质粒；优选地，所述白色念珠菌DNA片段、热带念珠菌DNA片段、近平滑念珠菌DNA片段、克柔念珠菌DNA片段和光滑念珠菌DNA片段的核苷酸序列分别如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；优选地，所述辅助试剂包括Taq酶、dNTP、MgCl2、DMSO和SYBRGreenI染料。5.一种念珠菌分种检测的方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的DPO引物对、权利要求3或4所述试剂盒的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)分别以待测样本的DNA、阴性质控的质粒和阳性质控的五种质粒为模板，加入权利要求1所述DPO引物对、Taq酶、dNTP、MgCl2、DMSO和SYBRGreenI染料，进行实时荧光PCR反应；(2)通过产物的扩增曲线和熔解曲线分析判断样品中是否存在念珠菌并确定念珠菌菌种。7.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志贤，阎香言，盛长忠，周泽奇，粟艳，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12