本发明专利技术公开一种采用C型口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)制备的检测试剂盒及制备方法。本发明专利技术的试剂盒的制备方法是将HRP直接标记在跟被检抗体同时作用的竞争性抗体上，其内酶标板包被的C型口蹄疫病毒样颗粒是由C型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1和VP3组装而成。本发明专利技术采用的VLPs能高效组装，且不影响其诊断效率，有利于降低诊断制剂的成本。本发明专利技术方法相对现有技术的检测步骤有所减少，实验操作简单，工作量小，用时短，并可提高诊断试剂的特异性和敏感性。
A competitive ELISA kit for detection of foot-and-mouth disease virus type C antibody based on virus-like particles
The invention discloses a detection kit prepared by type C foot-and-mouth disease virus-like particles (VLPs) and a preparation method thereof. The preparation method of the kit is that HRP is directly labeled on a competitive antibody which acts simultaneously with the detected antibody, and the type C foot-and-mouth disease virus-like particles coated with the enzyme label plate are assembled by the structural proteins VP0, VP1 and VP3 of the type C foot and mouth disease virus. The VLPs adopted in the invention can be assembled efficiently without affecting the diagnostic efficiency, and is beneficial to reducing the cost of the diagnostic preparation. Compared with the existing technology, the method has the advantages of less detection steps, simple experiment operation, less workload and short time, and can improve the specificity and sensitivity of diagnostic reagents.
【技术实现步骤摘要】
一种基于病毒样颗粒的C型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒
本专利技术涉及一种C型口蹄疫病毒样颗粒的竞争ELISA抗体检测试剂盒。
技术介绍
口蹄疫(Foot-and-mouthDisease，FMD)是由口蹄疫病毒引起的人兽共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，传播迅速，流行面广，幼龄动物死亡率较高。FMDV属于小RNA病毒，宿主范围广，可通过多种途径传播，造成世界范围内的大流行。其临诊症状是在口腔黏膜、四肢下端及乳房等处皮肤形成水疱和烂斑。FMD流行给世界养殖业造成了巨大经济损失。目前，国际动物卫生组织(OIE)将FMD列为法定上报传染病。FMDV具有多型性、易变异的特点，根据其血清型特性，可分为7个血清型，即A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型及AsiaI型。C型口蹄疫最早于1962年被报道，与其他各型口蹄疫相比流行范围较小，目前仅在欧洲、南美、东非、北非、安哥拉以及南亚有报道。最近一次报道C型口蹄疫的爆发是2004年在巴西和肯尼亚。目前C型口蹄疫在我国还未见报道，但是我国周边国家和地区的口蹄疫疫情很严重，且有C型口蹄疫流行史，这使得我国的口蹄疫防控局势异常严峻。因此，快速、高效的诊断和监测技术对FMD的防控至关重要。
技术实现思路
本专利技术提供一种可克服现有技术不足，用于检测C型口蹄疫病毒抗体的竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法。本专利技术的C型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒内包括有：包被C型口蹄疫病毒样颗粒的酶标板、HRP标记的兔抗、含有吐温和磷酸盐缓冲液的样品稀释液和洗涤液、TMB底物、阳性对照血清、阴性对照血清、以及浓硫酸与水混合的终止液。本专利技术的C型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法是将HRP直接标记在跟被检抗体同时作用的竞争性抗体上，其制备过程包括：用C型口蹄疫病毒样颗粒免疫兔，免疫结束后，从兔心脏采血，分离血清并用ProteinA亲和层析法分离纯化得到IgG，采用过碘酸钠方法将HRP标记到IgG上。优选地，本专利技术的C型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其内酶标板包被的C型口蹄疫病毒样颗粒是由C型口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、VP1和VP3组装而成，VP0、VP1和VP3的序列分别为SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3。优选地，本专利技术的C型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其酶标板制备是用0.05％(pH＝9.6)的碳酸盐包被缓冲液将C型FMDVVLPs稀释为5μɡ/mL，以每孔100μL的量加入酶标板，4℃包被过夜，洗涤液洗板3次；加入以酶标板稳定剂配制的含1％BSA封闭液，每孔120μL，37℃恒温箱封闭1h，洗板3次，干燥，真空包装。病毒样颗粒(VLPs)是由口蹄疫病毒的结构蛋白(VP1、VP2和VP3)组装形成的空心颗粒，具有和天然病毒粒子相同形态结构，不含病毒遗传物质，不能自主复制。同时结构蛋白组装成VLPs时，通过各亚单位之间的相互作用可以形成单个蛋白不具有的立体构象。因此相对于全病毒和单个病毒蛋白，本专利技术以VLPs作为抗原检测抗体具有更好的安全性和免疫原性。目前已在不同的表达系统中成功表达出许多病毒的衣壳蛋白并检测到组装好的VLPs，这为VLPs作为ELISA试剂盒抗原和疫苗的利用及开发提供了条件。现在应用在疫苗研究方面的VLPs主要有：HPV、HEV、EV71、HBV、HCV、HIV。VLPs还可以通过融合表达或化学方法连接外源肽构建嵌合VLPs，以增强其作为预防和治疗性疫苗的潜力。VLPs可以替代天然病毒在免疫学检测中发挥重要的作用，有研究显示，以基因工程制备的HPVVLPs作抗原，通过ELISA方法检测HPV患者血清中的抗体，与HPVDNA检测结果一致。FMDV结构蛋白在体外可自组装成为VLP，以大肠杆菌表达系统表达的FMDV结构蛋白组装成的VLPs，具有良好的免疫原性，可以作为包被抗原建立用于C型FMDV抗体检测的诊断方法。本专利技术具有如下优点：1.本专利技术首次用C型FMDVVLPs作为包被抗原，建立的竞争ELISA方法相对于传统的以灭活病毒为抗原的ELISA方法具有安全性高，特异性好的特点，可对血清中的C型FMDV的抗体水平进行快速检测。2.本专利技术使用HRP标记竞争抗体，使得反应过程只需两步就可以完成，相对于专利CN105445457A、CN107064501A等ELISA方法用时短，操作简单，整个过程只需45分钟就可完成。3.由于病毒的结构蛋白在组装成VLPs的过程中可以形成单个蛋白不具有的立体结构，且抗原位点重复展示，因此相对于蛋白或多肽使用VLPs作为包被抗原具有更高的敏感性和特异性，也可以有效的避免种属交叉反应。4.本专利技术应用大肠杆菌表达系统表达病毒的衣壳蛋白组装VLPs，具有经济、廉价、易于推广的优点。具体实施方式本专利技术以下结合实施例解说。1.C型FMDVLPs的制备1.1目的蛋白的表达及纯化(1)将本实验室保存的C型阳性重组质粒p-SMK-VP0VP3和p-SMK-VP1共转化至感受态细胞BL21(DE3)-RIL，表达菌按1:100的比例接种到含有10μg/mL卡那霉素、50μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的经高压灭菌的新鲜LB液体培养基中，在37℃、220r/min摇床上培养至菌液OD600为0.6～0.8。加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，并于16℃条件下诱导16h。C型阳性重组质粒p-SMK-VP0VP3和p-SMK-VP1序列分别为：SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和SEQIDNo.3.。(2)4℃4000r/min离心30min收集菌体。超声破碎20～24min，4℃11000r/min离心30min收集上清。(3)将上清与已平衡好的Ni2+亲和层析柱于4℃结合1h。弃掉流穿液，先用10个柱体积BufferA洗液(20mMTris-HCl，500mMNaCl，20mM咪唑，3‰TritonX-100，pH＝8.0)洗脱杂蛋白，然后BufferB洗液(20mMTris-HCl，500mMNaCl，500mM咪唑，3‰TritonX-100，pH8.0)将目的蛋白洗脱，(4)收集洗脱液，然后用SDS-PAGE电泳实验鉴定得到的蛋白。测定蛋白浓度后于-80℃保存备用。1.2VLPs的体外组装将带有His-SUMO标签的目的蛋白与SUMO酶按100:1的比例于透析袋中，在500mL的酶切缓冲液中，4℃过夜酶切和组装。收集VLPs，进行SDS-PAGE和WB鉴定，于-80℃保存备用。将VLPs室温吸附到碳膜包被的铜网上5min，用滤纸吸去铜网上多余的液体，用3％的磷酸钨负染5min后，滤纸吸去多余液体，最后在透射电镜下观察样品VLPs，大小约20-40nm，DLS检测的VLPs直径与TEM的基本一致。2.高免血清的制备2.1动物免疫将4只实验兔分为两组即A组(3只)和B组(1只)，A组为实验组，B组为对照组，以C型口蹄疫VLPs免疫兔子，具体免疫方法见下表。每次免疫前于耳缘静脉处采血，测定效价。最后一次抗原免疫后第14d，从兔心脏采血，分离血清，经离心去掉细胞等组织碎片后，分装保存-80℃备用。2.2IgG的纯化和HRP标记2.2.1I本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种C型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒内包括有：包被C型口蹄疫病毒样颗粒的酶标板、HRP标记的兔抗、含有吐温和磷酸盐缓冲液的样品稀释液和洗涤液、TMB底物、阳性对照血清、阴性对照血清、以及浓硫酸与水混合的终止液。
【技术特征摘要】
1.一种C型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于检测试剂盒内包括有：包被C型口蹄疫病毒样颗粒的酶标板、HRP标记的兔抗、含有吐温和磷酸盐缓冲液的样品稀释液和洗涤液、TMB底物、阳性对照血清、阴性对照血清、以及浓硫酸与水混合的终止液。2.权利要求1所述的C型口蹄疫病毒抗体竞争ELISA检测试剂盒制备方法，其特征在于HRP直接标记在跟被检抗体同时作用的竞争性抗体上，其制备过程包括：用C型口蹄疫病毒样颗粒免疫兔，免疫结束后，从兔心脏采血，分离血清并用ProteinA亲和层析法分离纯化得到IgG，采用过碘酸钠方法将HRP标记到IgG上。3.根据权利要求2所述的C型口蹄疫病毒抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙世琪，白满元，郭慧琛，张韵，茹嘉喜，杨志元，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62
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