一种赤星病孢子在线捕集检测方法及捕集检测系统技术方案

本发明专利技术公开了一种赤星病孢子在线捕集检测方法及捕集检测系统，该系统集成了捕集液捕集，捕集量更大，同时还具有免疫检测、荧光定量、在线读取与GPS传输数据、自动预警等优点。服务器将检测结果进行数字化转换后，一般烟基人员和烟农都能够读懂数据与结果，使得系统操作更加简单实用。本发明专利技术实时在线检测，用于在线监测空气赤星病分生孢子的数量，利于早期预防烟草赤星病的爆发风险。解决了现有条件下，没有办法早期判断赤星病爆发风险，而赤星病属于叶斑病菌，随空气传播，传播速度快，一旦爆发，基本没有办法防治的问题。

An on-line detection method and system for spore capture and detection of Alternaria alternata

The invention discloses an on-line collection and detection method and a collection and detection system for spores of Alternaria alternata. The system integrates the collection of catching liquid, and has the advantages of immune detection, fluorescence quantification, on-line reading and GPS transmission data, automatic early warning, etc. After the server digitalizes the test results, the general smoke-based personnel and farmers can understand the data and results, making the system operation more simple and practical. The real-time on-line detection of the invention is used for on-line monitoring the number of conidia of air brown spot disease, and is beneficial to early prevention of the outbreak risk of tobacco brown spot disease. Under the existing conditions, there is no way to judge the outbreak risk of brown spot disease in early stage, and brown spot disease belongs to leaf spot pathogen. With the spread of air, the transmission speed is fast. Once the outbreak occurs, there is basically no way to prevent and control it.

【技术实现步骤摘要】
一种赤星病孢子在线捕集检测方法及捕集检测系统
本专利技术涉及病菌捕集检测
，具体涉及一种赤星病孢子在线捕集检测方法及捕集检测系统。
技术介绍
大田期烟草病害主要有黑胫病、赤星病、野火病、花叶病等，其中烟草赤星病是四川烟草种植区的主要病害之一，其为真菌病害，通过叶片感染而使烟株发病。赤星病的发病和烟叶成熟衰老程度高度相关，随着烟叶成熟度增加，烟叶抗病性下降，一旦发生就会给烟叶生产带来巨大损失，2016年和2017年的四川烟区因为赤星病造成的损失为1700万和2100万。赤星病菌可以通过分生孢子快速传播，在短时间内大规模爆发，对赤星病的田间、快速、高灵敏检测提出了技术挑战。目前，针对赤星病菌的检测技术已有文献报道，如常规组织分离方法、血清学的酶联免疫吸附法和聚合酶链（PCR)反应等。但是，这些检测技术大多都针对非烟草作物，如苹果，梨等经济作物，它们与烟草存在基因和种属差异，能否应用在烟草赤星病的控制存在一定的疑问。同时，这些检测技术均为实验室分析技术，难以实现田间、快速、高灵敏的烟草赤星病分析。为了解决这些问题，国家局科技司在《烟草绿色防控重大专项2018年技术方案》中要求“研发赤星病/野火病精准预警和早期预防的协同应用关键技术”，以控制烟草赤星病的传播。烟草赤星病（AlternariaAlternata）的病原为链格孢属真菌，属半知菌亚门（Deutermyccotina），丝孢纲（Hyphomycetes），丝孢目（Hyphomycetoles），链格孢属（Alteraria）。最初报道的病原学名是Macrosporiumlongipes，隶属于格孢属；1928年由E.W.Mason定义为长柄链格孢[Alternarialongipes(ELL.&Ev.)Masonl]，隶属于链格孢属，并沿用至今。烟草赤星病（AlternariaAlternata）是一类由链格孢菌引起的烟株成熟后期病害。该病1892年首次在美国发现。1916年我国首次在北京附近发现，80年代以来，全国各烟区有日益严重的趋势。1992年是特大的流行年，黄淮烟区损失很大，河南烟区发病面积为70万亩，其中10万亩是毁灭性的，共减产5000万公斤，产值损失和人民币1亿元左右。1.病害的发生流行规律1.1病原真菌的越冬与传播田间烟叶成熟采收后，赤星病菌随着病株的残体遗落田间越过严冬；有的病菌转移到已死亡的杂草上越过严冬。第二年春天，气温回升，湿度大时，又重新形成新的分生孢子，靠风雨传播浸染新的烟草。1.2初浸染与再浸染据观察，在越冬场所的病菌，当早春气温达7.8℃，相对湿度50%的条件下，开始产生分生孢子，以后随气温的上升，产生孢子的数量越大，由风雨传播，浸染周围的烟株，成为初浸染的菌源中心。这些发病的烟株，在病斑上再产生孢子，又由风雨传播，形成再次浸染，条件适合时，可以多次再浸染，病株死亡后，此病菌菌丝又随病残组织而越冬。1.3侵入过程降落在叶片上水膜中的孢子，萌发形成芽管，从叶正面或叶背面侵入，最易于从叶毛细胞基部、叶缘细胞和虫伤处侵入，有时可从气孔侵入。侵入烟组织的菌丝，在细胞间生长，破坏中胶层，最敏感的细胞首先溃烂，进而里面的组织溃烂。在适温下，潜育期很短，只需48小时就出现症状，如遇低温，可延长到5~8天。2国内发病状况根据湖南省2013年10个烟叶种植市州（郴州、永州、衡阳、长沙、株洲、常德、邵阳、湘西、张家界、怀化）、及2014~2016年代表性区域湘南烟区（郴州、永州）)、湘中烟区（长沙、衡阳）和湘西烟区（湘西）病害情况的调查结果表明，赤星病是湖南烟区主要的叶斑类病害，分布于全省烟区，2014年~2016年间总体发病率介10%~45%，其中2015年暴发流行。湘南地区发病最重。对于云南烟区，已查明的烟草病虫害中，以赤星病、病毒病和烟蚜发生面积最大。赤星病常年发生面积约3.33万hm2，造成烟叶最高减产28.56%，产值损17.54%~89.67%。根据2016年~2017年青州所四川烟区病害调查结果，赤星病造成的损失为1700万和2100万。重庆烟区根据2011年至2013年间共采集的205份样本的真菌类病害鉴定结果可知，烟草赤星病达19.0%。根据2013年~2015年陕西烟田病害的调查结果，在降雨量较多的8月，烟田赤星病发病株率为5.29%~8.75%，严重田块发病株率高达32.94%~51.63%，是陕西烟草生产中的主要真菌病害。3现有诊断和防控技术随着分子技术的不断发展，传统的组织培养方法已逐渐发展为分子生物学方法或与其相结合的新方法。较为常见的方法有平板培养法，定量链式聚合酶核酸扩增法（PCR），环介导等温扩增反应法（LAMP），酶联免疫吸附法(ELISA)法等。3.1常规培养基分离方法赤星病菌传统检测方法主要采用培养基分离法。包括非选择性培养基和半选择性培养基。传统组织分离方法最大的缺点是检测周期长(需3-7d)，且灵敏度较低，不能适应植物检疫和实验室快速鉴定的需要，但是可检测出样品中活菌的数量，同时还可以反映病菌致病力的强弱。随着对赤星病病原菌检测方法研究的不断深人，一些快速灵敏的检测技术及方法已经被广泛建立及采用，如血清学法等。3.2免疫分析技术免疫分析方法基本原理是利用抗原抗体特异性结合，对植物样品中的赤星菌进行检测，是目前较为灵敏、简便和实用的方法，可以在2h内完成病原鉴定，并且可以检测出样品中病原菌的实际数量。ELISA的血清学技术都具有较高的检测灵敏度、简便实用的特点，但免疫分析最大的缺点是抗体的制备过程费时耗力，且可能存在交叉反应而造成检测结果呈假阳性，而单克隆抗体能够较好的避免交叉反应的影响，目前已经成为烟草病虫害控制的重要手段。目前针对赤星病菌的抗体开发都是针对其他植物的，比如苹果，梨以及一些人过敏原的链格孢属真菌，它们和烟草赤星病菌属于同一种属，这些可以为烟草赤星病特异性抗体的开发提供借鉴。最近的研究结果表明，赤星病真菌抗体的制备主要有两条技术路线，即以赤星病分泌蛋白为抗原制备抗体和以赤星病菌分泌毒素为抗原制备抗体。其中，外泌蛋白是目前应用较多的抗体制备技术，也形成了一系列的ELISA方法，分泌蛋白主要是赤星病致病原Alta1,Alta2,Alta3,Alta6和Alta8等，应用的领域主要是链格孢属真菌致人过敏的检测。在经济作物领域，Takashi领导的研究小组在FEMSMicrobiolRev上发表综述，介绍链格孢属真菌可以在宿主植物上产生小分子量的宿主选择性毒素，毒素的释放始于渗透前的萌发分生孢子，抑制宿主植物细胞的抗性。在烟草领域，Slavov开展了深入的研究，他们认为烟草赤星病真菌会在发芽胞子24小时内，释放出具有宿主特异性的有毒物质，帮助病菌侵染烟草，这些为烟草特异性毒素为后续烟草赤星病特异性抗体的开发提供了依据。3.3分子生物学方法应用分子生物学技术检测方法主要包括核酸分子杂交检测法和聚合酶链式反应(PCR)检测法以及在PCR技术的基础上扩展的RAPD、RT—PCR、REP—PCR和AFLP指纹识别技术等，分子生物学方法具有灵敏、特异和高效等特点，大大提高了植物赤星病原菌的检测效率，已被广泛应用于赤星菌与寄主互作、病原流行学和病原检测中。以核酸序列分析为基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种赤星病孢子在线捕集检测系统，其特征在于包括供电系统：为在线捕集检测系统中的设备提供所需电力；服务器：分析检测空气中赤星病孢子含量，并将结果显示出来；空气采样器：采集所需检测区域的空气；捕集池：与空气采样器连通，捕集池内存储有捕集液，空气进入捕集池后溶解于捕集液之中；储液池：与捕集池连通，并为捕集池补充捕集液；检测池：与捕集池连通，空气在捕集池中溶解于捕集液后，捕集液被输送至检测池内；试纸条：试纸条安装在检测池内，采集捕集液；检测仪：与服务器有线或无线连接，对试纸条采集的捕集液进行检测，并将检测得到的信息传送至服务器。

【技术特征摘要】
1.一种赤星病孢子在线捕集检测系统，其特征在于包括供电系统：为在线捕集检测系统中的设备提供所需电力；服务器：分析检测空气中赤星病孢子含量，并将结果显示出来；空气采样器：采集所需检测区域的空气；捕集池：与空气采样器连通，捕集池内存储有捕集液，空气进入捕集池后溶解于捕集液之中；储液池：与捕集池连通，并为捕集池补充捕集液；检测池：与捕集池连通，空气在捕集池中溶解于捕集液后，捕集液被输送至检测池内；试纸条：试纸条安装在检测池内，采集捕集液；检测仪：与服务器有线或无线连接，对试纸条采集的捕集液进行检测，并将检测得到的信息传送至服务器。2.根据权利要求1所述的一种赤星病孢子在线捕集检测系统，其特征在于，所述服务器中还包括警示模块，如检测结果中含有赤星病孢子则发出警示。3.根据权利要求1所述的一种赤星病孢子在线捕集检测系统，其特征在于，所述检测池还连接有废液回收池，且在检测池上设置有试纸条储存盒。4.根据权利要求1所述的一种赤星病孢子在线捕集检测系统，其特征在于，所述检测池和捕集池之间通过柱塞泵连通，所述供电系统采用太阳能供电系统。5.根据权利要求1所述的一种赤星病孢子在线捕集检测系统，其特征在于，所述空气采样器为液体撞击式微生物气溶胶采样器，气体流速为8-12L/min，单次有效捕集总生物气溶胶的时间为6-8小时。6.根据权利要求1所述的一...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶晓秋，熊巍，唐纲岭，范子彦，边照阳，李中皓，张海燕，邓惠敏，庞夙，靳冬梅，韶济民，黄玫，李霞，刘珊珊，杨兵，李晨曦，蒲宁，
申请(专利权)人：中国烟草总公司四川省公司，国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：四川,51