一种测序文库构建试剂盒及其使用方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种测序文库构建试剂盒及其使用方法和应用。该试剂盒包括限制性内切酶及限制性内切酶反应的缓冲液，DNA连接酶及连接酶缓冲液，末端修复试剂，测序接头，PCR引物以及PCR扩增体系，所述末端修复试剂包括T4多聚核苷酸激酶，T4 DNA聚合酶，Klenow DNA聚合酶，dNTPs和修复缓冲液。由该试剂盒获得的基因组的序列很大程度上来自于原基因组上的不同位置(间隔>500bp以上)，使得用来分析基因组拷贝数变异时，能够提高原有数据的利用效率150％以上。

A Kit for Sequencing Library Construction and Its Application

The invention relates to the field of gene detection, in particular to a sequencing library construction kit, its use method and application. The kit includes restriction endonuclease and restriction endonuclease reaction buffer, DNA ligase and ligase buffer, terminal repair reagent, sequencing connector, PCR primer and PCR amplification system. The terminal repair reagent includes T4 polynucleotide kinase, T4 DNA polymerase, Klenow DNA polymerase, dNTPs and repair buffer. The genome sequence obtained by this kit is largely from different locations in the original genome (spacing > 500 bp), which can improve the utilization efficiency of available data by more than 150% when used to analyze genome copy number variation.

【技术实现步骤摘要】
一种测序文库构建试剂盒及其使用方法和应用
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种测序文库构建试剂盒及其使用方法和应用。
技术介绍
拷贝数变异(Copynumbervariation,CNV)是指基因组片段发生了拷贝数的增加或减少，涉及的基因组序列大小从1kb到多个Mb不等，主要是由于基因组发生重组而导致。CNV是一种广泛存在于动物基因组中的遗传多态性现象，它的突变频率远高于SNP。有些CNV不引起表型变化，而另一些CNV则会影响基因的表达与功能，最终导致人类疾病的发生，因此CNV的研究具有重大的科研和临床意义。目前检测CNV的技术主要有：高分辨率核型分析技术，免疫荧光原位杂交技术(FluorescentInSituHybridization,FISH)，染色体微阵列分析技术(ChromosomeMicroarrayAnalysis,CMA)，多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependentprobeamplification,MLPA)以及二代测序技术(Next-generationSequencing,NGS)。高分辨率核型分析技术是检测染色体异常的金标准，但是其分辨率较低(约5Mb)，无法检出染色体小片段的拷贝数变异。免疫荧光原位杂交技术利用荧光标记探针和染色体进行原位杂交，根据特定的同位素荧光信号在分子水平上检测染色体数目和结构异常。相对于核型分析技术，FISH检测周期更短，精度更高，但是由于探针的设计受到目标区域的限制，只能得到有限的染色体信息。染色体微阵列分析技术(CMA)是一种高通量检测基因组拷贝数变异的分子核型技术，包括比较基因组杂交(aCGH)技术和单核苷酸多态性基因芯片(SNParray)技术。相比于FISH，CMA具有更高的分辨率和灵敏度，全基因组覆盖，不过均一性不好，容易漏检，且检测成本较高，限制了在临床的应用。MLPA是一项基于PCR的检测CNV变化的技术，可以检测出DNA特异性序列间的拷贝数差别。MLPA可以对一个样本的几十上百个位点进行同时检测，不过操作过程繁琐，位点依然有限，容易造成PCR产物的污染。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术所提供的技术方案是：一种测序文库构建试剂盒，具体包括：限制性内切酶及限制性内切酶反应的缓冲液，DNA连接酶及连接酶缓冲液，末端修复试剂，测序接头，PCR引物以及PCR扩增体系；所述末端修复试剂包括T4多聚核苷酸激酶，T4DNA聚合酶，KlenowDNA聚合酶，dNTPs和修复缓冲液。所述限制性内切酶试剂包括AseI，CviQI，NdeI，AciⅠ，AluⅠ，BfaⅠ，HaeⅢ，HhaⅠ，MseⅠ，AsiSI，CviAII，PacI，PvuI，PvuI-HF，HpyCH4IV或HpySE526I中的一种或几种。所述DNA连接酶试剂包括DNAligase、T4DNAligase、taqDNAligase或ligase-65的一种。所述PCR引物包括上游引物和下游引物。所述PCR扩增体系包括DNA聚合酶，dNTPs，扩增缓冲液。本专利技术还包括一种测序文库构建试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：将样本基因组DNA进行片段化处理，获得第一DNA片段组；在所述第一DNA片段组加入末端修复试剂，置于PCR仪上进行反应获得末端修复的第二DNA片段组；将所述第二DNA片段组与DNA连接酶，测序接头，连接酶缓冲液，无核酸酶去离子水混合，置于PCR仪上反应获得接头连接DNA片段组，并对所述接头连接DNA片段组进行纯化；将所述纯化后的接头连接DNA片段组加入PCR引物和PCR扩增体系，在预定的扩增程序下进行扩增获得扩增基因组，并对所述扩增基因组进行纯化；将所述纯化后的扩增基因组进行检测，获得测序文库。所述将样本基因组DNA进行片段化处理，获得第一DNA片段组的方法，具体包括以下步骤：将样品基因组DNA与限制性内切酶，限制性内切酶缓冲液混合置于PCR仪上反应获得第一酶切DNA片段组；将所述第一酶切DNA片段组与DNA连接酶，连接酶缓冲液，无核酸酶去离子水混合置于PCR仪上反应获得第一连接DNA片段组，并采用磁珠纯化；将所述纯化后的第一连接DNA片段组采用物理法或者酶解法打断获得第一DNA片段组。本专利技术还提供了另一种将样本基因组DNA进行片段化处理，获得第一DNA片段组的方法，具体包括以下步骤：将样品基因组DNA采用物理法打断，并加入限制性内切酶和限制性内切酶缓冲液混合均与，置于PCR仪上反应获得第二酶切DNA片段组；将第二酶切DNA片段组与DNA连接酶，连接酶缓冲液，无核酸酶去离子水混合置于PCR仪上反应获得第二连接DNA片段组，并进行纯化；所述纯化后的第二连接DNA片段组为第一连接DNA片段组。所述预定的扩增程序包括以下步骤：95℃预变性3分钟；循环反应，95℃变性20秒，60℃退火15秒，72℃延伸30秒，共循环4-8次；72℃延伸5分钟。有益效果：利用本专利技术的测序文库构建试剂盒，将基因组DNA进行片段化出里，末端修复，接头连接、纯化等步骤构建测序文库，在进行拷贝数变异测序时，双端测序的read1和read2的序列很大程度上来自于基因组上的不同位置(间隔>500bp以上)，使得用来分析基因组拷贝数变异时，read1和read2都能得以利用，提高原有数据的利用效率150％以上。附图说明图1为本专利技术实施例二提供的一种测序文库构建方法的原理图；图2为本专利技术实施例二第一酶切DNA片段组和第一连接DNA片段组的琼脂糖凝胶电泳图；图3为本专利技术实施例三提供的一种测序文库构建方法的原理图；图4为本专利技术实施例三中的第二酶切DNA片段组的琼脂糖凝胶电泳图；图5为本专利技术实施例三中的第二连接DNA片段组的琼脂糖凝胶电泳图；具体实施方式为了更加清楚阐述本专利技术的
技术实现思路
，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的
技术实现思路
显而易见地得出的其他技术方案仍属于本专利技术的保护范围。原理解释：利用二代高通量测序数据进行CNV分析的一个主要思路是根据一定大小的滑动窗口(Window，比如1Mb)内读段深度(用Cluster提供的坐标信息的个数来表示)来指示拷贝数增加(Duplication)与缺失(Deletion)，这种分析原则得以成立的前提是测序文库中的DNA片段在基因组上的分布符合泊松分布现象，二代高通量测序中每条DNA序列信号来源的起点叫做Cluster，每个Cluster的信息通常由Read1和Read2组成，Read1和Read2通过将呈现出来的序列信息与参考基因组进行比对，就能获得Read1和Read2在参考基因组上的坐标信息。实施例1：本专利技术提供了一种用于测序文库构建的试剂盒，具体包括限制性内切酶，限制性内切酶缓冲液，末端修复试剂，DNA连接酶试剂组，连接酶缓冲液，测序接头(01-96)，PCR引物组，PCR反应体系。其中限制性内切酶为AseI，CviQI，NdeI，AciⅠ，AluⅠ，BfaⅠ，HaeⅢ，HhaⅠ，MseⅠ，AsiSI，CviAII，PacI，PvuI，PvuI-HF，HpyCH4IV，HpySE526I中的一种或几种的组合，应当理解的是可以根据测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测序文库构建试剂盒，其特征在于，具体包括：限制性内切酶及限制性内切酶反应的缓冲液，DNA连接酶及连接酶缓冲液，末端修复试剂，测序接头，PCR引物以及PCR扩增体系；所述末端修复试剂包括T4多聚核苷酸激酶，T4DNA聚合酶，Klenow DNA聚合酶，dNTPs和修复缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种测序文库构建试剂盒，其特征在于，具体包括：限制性内切酶及限制性内切酶反应的缓冲液，DNA连接酶及连接酶缓冲液，末端修复试剂，测序接头，PCR引物以及PCR扩增体系；所述末端修复试剂包括T4多聚核苷酸激酶，T4DNA聚合酶，KlenowDNA聚合酶，dNTPs和修复缓冲液。2.根据权利要求1所述的测序文库构建试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶试剂包括AseI，CviQI，NdeI，AciⅠ，AluⅠ，BfaⅠ，HaeⅢ，HhaⅠ，MseⅠ，AsiSI，CviAII，PacI，PvuI，PvuI-HF，HpyCH4IV或HpySE526I中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的测序文库构建试剂盒，其特征在于，所述DNA连接酶试剂包括DNAligase、T4DNAligase、taqDNAligase或ligase-65的一种。4.根据权利要求1所述的测序文库构建试剂盒，其特征在于，所述PCR引物包括上游引物和下游引物。5.根据权利要求1所述的测序文库构建试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系包括DNA聚合酶，dNTPs，扩增缓冲液。6.一种测序文库构建试剂盒的使用方法，其特征在于，具体包括以下步骤：将样本基因组DNA进行片段化处理，获得第一DNA片段组；在所述第一DNA片段组加入末端修复试剂，置于PCR仪上进行反应获得末端修复的第二DNA片段组；将所述第二DNA片段组与DNA连接酶，测序接头，连接酶缓冲液，无核酸酶去离子水混合，置于PCR仪上反应获得接头连接DNA片段组，并对所述接头连接DNA片段组进行纯化；将所述纯化后的接头连接DNA片段组...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊峰，汪进平，郭长全，李仁强，欧阳虎，陈云弟，
申请(专利权)人：阅尔基因技术苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32