一种耳聋相关基因文库的构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种耳聋相关基因文库的构建方法，针对耳聋相关致病基因每个编码序列，由5’往3’方向，按序列反向互补原则设计探针序列，在每个探针序列的连接接头，采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成；用氨水将芯片上的寡核苷酸洗脱形成寡核苷酸混合物；通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的引物，形成带生物素标记的耳聋相关致病基因DNA探针文库。本发明专利技术实现了对耳聋相关的已知位点的高通量筛查方法，较单独进行位点筛查和全基因组或者全外显子测序的检测更快速、经济、简便，且对设备及环境要求低，利于推广和应用，适用于耳聋相关人群的筛查和预防性检查。可在检测线粒体DNA的SNP位点中的应用。

Construction and application of a deafness-related gene library

The invention provides a method for constructing a gene library related to deafness. For each coding sequence of deafness-related pathogenic genes, the probe sequence is designed from 5'to 3', according to the principle of sequence reverse complementarity, and the connector of each probe sequence is used for large-scale synthesis of oligonucleotides on the chip by in situ oligonucleotide synthesis technology; and oligonucleotides on the chip are synthesized by ammonia water. The oligonucleotide mixture was formed by acid elution, and the DNA probe library of the deafness-related gene with biotin marker was constructed by using 5'-terminal primers with biotin marker by PCR. The invention realizes a high-throughput screening method for known sites related to deafness, which is faster, more economical and simple than single site screening and genome-wide or exon-wide sequencing, and has low requirements for equipment and environment, which is conducive to popularization and application, and is suitable for screening and preventive examination of deafness-related people. It can be used to detect SNP loci of mitochondrial DNA.

【技术实现步骤摘要】
一种耳聋相关基因文库的构建方法和应用
本专利技术属于生命科学与生物
，涉及一种耳聋相关基因文库的构建方法，以及利用该方法全面检测线粒体DNA的SNP位点的应用。
技术介绍
耳聋是导致言语交流障碍的常见疾病，严重影响人们的身心健康和生活质量。2006年第二次残疾人抽样调查显示，我国现有听力言语残疾人口约2780万，其中7岁以下聋哑儿童达80万人，且每700-1000个新生儿中就有1例聋儿。耳聋可分为非综合征型耳聋和综合征型耳聋，其中约70％的患者为非综合征型耳聋，即仅表现为单一听力障碍的临床症状；而综合征型耳聋除听力障碍外，往往伴有其他异常临床症状。环境因素和遗传因素均可引起耳聋。其中，20-30％的耳聋患者有氨基糖甙类抗生素的用药史，如庆大霉素、链霉素、卡那霉素和新霉素等；超过50％的耳聋患者具有遗传基础或遗传易感体质，表现为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁遗传和母系遗传。随着高通量测序技术的发展与成熟，人全基因组测序已经成为耳聋相关致病基因突变研究和诊断的重要工具。通过全基因组测序对被测样本进行全基因组扫描，可实现对基因突变零遗漏，从而成为耳聋相关致病基因突变研究和诊断的有效工具。由于人类基因组的大小约为3Gb，对其进行全基因组测序总计约需90Gb测序数据。巨大的数据量要求所致高昂的测序成本，导致全基因组测序应用于耳聋的基因诊断受到限制。全基因组测序和全外显子测序需要产生大量的测序数据量，测序成本高，因此测序深度不可能太深。对于检查基因突变而言，想要实现突变检查的零遗漏，全基因组测序确实难以担当此任。特别是对于，一次检测数百个基因上发生的所有突变，高深度测序才能实现对突变检测的准确性。因此，开发一款价格低廉的，准确性高的基因突变检查产品，特别是对于耳聋基因突变的诊断产品，具有重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前检测耳聋相关的目的基因的方法所存在的缺点，提供一种耳聋相关基因文库的构建方法，是一种具有快速、高通量特点，更好的有利于高效、快速、便捷、经济的进行耳聋相关的目的区域DNA全序文库的构建方法。本专利技术方法可以成为进行高通量测序的一种试剂盒构建方法。本专利技术涉及一种制备基因耳聋相关的DNA探针文库的方法，主要由全基因组DNA打断后的加A尾的体系、接头连接体系、纯化体系、PCR前反应体系、探针杂交体系、PCR后反应体系等6个组分构成，通过以下步骤实现：(1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为90bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计246个基因；(2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示序列，形成两端带有接头序列；(3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物；(4)通过多重PCR接头连接的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC(SEQ:NO.3)和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC(SEQ:NO.4)，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。本专利技术对带有样本识别序列的接头探针，采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物。本专利技术所述基因选自表1中示出的耳聋相关致病基因246个，例如表1中的所有基因。本专利技术所述探针序列的长度为90bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp或80bp的重叠，共计246个基因。本专利技术所述基因选自表3中示出的耳聋相关靶向捕获致病基因，例如表3中的所有基因。本专利技术的另一个目的是提供所构建文库方法在全面检测耳聋相关核基因中的核苷酸多态性位点中的应用，通过以下步骤实现：1)根据人类参考基因组HG19，结合Ensembl、CCDS、Gencode、VEGA、SNP以及CytoBand数据库，获取实施例2表1中耳聋相关致病基因的所有编码序列；2)提取所述受试者的基因组DNA，将其打断至200-300bp的范围；3)针对每个编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为90bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在60bp或者80bp的重叠；4)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加序列和测序识别序列接头，形成两端带有同样序列的探针序列96条序列表的第5-100号，5)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列列表中的序列；6)通过PCR的方法，采用5’端带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和5’端带有同样标记的反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的耳聋相关致病基因DNA探针文库。反应体系如下：反应条件如下：7)对步骤4)获得的扩增产物进行上机测序，得到所述基因的测序数据；8)将步骤5)的测序数据与人类参考基因组进行比对，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。本专利技术的方法具有如下优点：(1)相对于全基因组测序，大大节约了所需要的测序数据量；(2)一次性检测疾病相关致病基因的所有突变，实现对疾病基因诊断的零遗漏，为疾病的治疗和干预提供保障；(3)高深度的测序，实现对基因突变的高准确性检测；(4)成本低，一次检测数百个基因上发生的所有突变；应用本专利技术提供的试剂盒进行mtDNA突变检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；(5)适合在一般医院、分子生物实验室开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行遗传性视神经病变相关的mtDNA突变的大规模筛查和预防性检查。(6)高深度测序实现对突变检测的准确性。附图说明图1是本专利技术的耳聋基因靶向捕获DNA文库构建示意图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。实施例1一种耳聋相关基因文库的构建方法本专利技术主要由全基因组DNA打断后的加A尾的体系、接头连接体系、纯化体系、PCR前反应体系、探针杂交体系、PCR后反应体系等6个组分构成：1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为90bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，共计246个基因；2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT和GTGACTGGAGTTCAGACGTG序列及特异性样本识别序列，形成两端带有接头序列；3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下列，形成寡核苷酸混合物。4)通过PCR的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耳聋相关基因文库的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为90bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计246个基因；(2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示序列，形成两端带有接头序列；(3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；(4)通过多重PCR接头连接的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。

【技术特征摘要】
1.一种耳聋相关基因文库的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)针对所述基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为90bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，所述每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3，共计246个基因；(2)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加如SEQ:NO.1和SEQ:NO.2所示序列，形成两端带有接头序列；(3)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，形成寡核苷酸混合物；(4)通过多重PCR接头连接的方法，采用5’端均带有生物素标记的正向引物TTAGATAGGTGTGTAGGCGC和反向引物TAAGGTGCGTACTAGCTGAC，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的基因DNA探针文库。2.根据权利要求1所述的一种耳聋相关基因文库的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述探针序列的长度为90bp，所述探针在每两个相邻的探针序列之间存在60bp或80bp的重叠。3.根据权利要求1所述的一种耳聋相关基因文库的构建方法，其特征在于，步骤(3)中的采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列，利用氨水把寡核苷酸从芯片上切割下...

【专利技术属性】
技术研发人员：管敏鑫，蒋萍萍，冀延春，郑静，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33