高度复用荧光成像制造技术

本文提供了用于分析样品的方法和系统。在一些实施方案中，所述方法利用各自与不同寡核苷酸连接的多种捕获剂和相应多个经标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针中的每一种仅与所述寡核苷酸中的一种特异性杂交。所述样品全体经捕获剂标记，并且使用所述经标记的核酸探针的相应亚组，使用迭代循环检测捕获剂的亚组。

Highly multiplexed fluorescence imaging

This paper provides a method and system for sample analysis. In some implementations, the method utilizes a variety of traps connected with different oligonucleotides and corresponding multiple labeled nucleic acid probes, each of which is specifically hybridized with only one of the oligonucleotides. The samples are all labeled with a trapping agent, and the corresponding subgroups of the labeled nucleic acid probes are used to detect the trapping agent subgroups by an iterative cycle.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】高度复用荧光成像政府支持本专利技术是按食品和药物管理局授予的合同HHSF223201210194C受政府支持完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。交叉引用本申请要求2016年7月27日提交的美国临时申请序列号62/367,530的权益，所述申请通过引用并入本文。专利技术背景抗体首先在1942年用于组织切片分析，以显现来自输注了活细菌的小鼠的器官活组织检查中的肺炎球菌抗原。从那时起，免疫组织化学已成为临床诊断和基础研究的支柱。然而，传统的免疫组织化学方法受到限制，因为它们只能够评估组织切片中一个、两个或三个(很少有更多个)表位的空间分布。这种约束条件限制了免疫组织化学在临床诊断中的应用，在该领域中非常期望分析更多数量的表位。已经描述了用于样品中表位检测的更新方法，并且涉及例如用DNA标记捕获剂，随后通过引物延伸检测该DNA，例如，如WO2015/200139和US20150368697中一样。本专利技术的方法是自动化的并且允许高度复用分析。因而，认为该方法满足常规免疫组织化学方法的一些不足之处。
技术实现思路
本文提供了一种用于分析样品的方法。在一些实施方案中，所述方法利用各自与不同寡核苷酸连接的多种捕获剂和相应多个经标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针中的每一种仅与所述寡核苷酸中的一种特异性杂交。所述样品全体经捕获剂标记，并且使用所述经标记的核酸探针的相应亚组，使用杂交/标记去除或灭活迭代循环进行检测捕获剂的亚组。在一些实施方案中，捕获剂未在杂交/去杂交循环之间从样品上剥离。根据如何执行该方法，该方法可用于检测样品中超过40个表位，而无需从样品上剥离捕获剂。附图说明技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图并非旨在以任何方式限制本教导的范围。图1：每个抗体偶联到长度为38-40个核苷酸的寡核苷酸(a)，其与较短的经染料标记的寡核苷酸(b)互补。图2：染料-寡核苷酸与DNA偶联抗体的杂交/去除。用DNA偶联的CD3抗体和Alexa647-偶联的CD19抗体为新鲜冷冻的人淋巴结组织染色。显示了相同组织区域跨越十个杂交/甲酰胺去除循环的合并的和单独的FITC/A647通道。图3：杂交迭代循环给出一致的染色图案。示出了来自图2的合并图像的放大区域。通过FITC-寡核苷酸与DNA偶联的CD3抗体的杂交显示的CD3染色在十个循环中是等同的。图4：DNA-寡核苷酸杂交动力学。在与DNA偶联的CD3抗体互补的经FITC标记的寡核苷酸杂交后测量荧光强度。在六个时间点测量杂交效率：30秒(A)、1分钟(B)、2分钟(C)、5分钟(D)、10分钟(E)和20分钟(F)。图5：通过甲酰胺动力学去除经染料标记的寡核苷酸。使用图4中使用的组织测量去除与DNA偶联的CD3抗体杂交的染料-寡核苷酸的最短时间。测试了四个时间点：30秒(A)、1分钟(B)、2.5分钟(C)和55分钟(D)。图6：随长度/Tm变化的经染料标记的寡核苷酸杂交效率。将与DNA偶联的CD3抗体互补的经染料标记的寡核苷酸设计成具有不同长度(8-30个核苷酸)和相应的Tm(分别为14.6-65.9℃)。使每个探针与用CD19-Alexa647和DNA偶联的CD3染色的不同人淋巴结组织切片杂交。通过所得FITC荧光强度测量杂交效率。图7：随长度/Tm变化的经染料标记的寡核苷酸甲酰胺去除效率。通过FITC荧光(绿色)失去量测量去除杂交的经染料标记的寡核苷酸的最小甲酰胺溶液量。图8：交叉杂交矩阵。筛选经染料标记的寡核苷酸文库和与CD45抗体偶联的寡核苷酸之间的交叉杂交。具有交叉杂交的寡核苷酸对具有非对角荧光强度。图9：每个寡核苷酸对的代表性细胞迹线。针对所有其他周期筛选具有正荧光强度的细胞。每条迹线的颜色与染料修饰对应：绿色＝FITC，蓝色＝Cy3，红色＝Cy5。图10：第一代序列正交寡核苷酸对。图11：自动化流体装置筛选。将成对的染料-寡核苷酸置于96孔板上的奇数/偶数孔中。每个流体循环递送T11-Cy5和T18-Cy3或T24-Cy5和T26-Cy3。绘制了五条代表性细胞迹线。图12：使用退火/去除经染料标记的寡核苷酸的循环对人扁桃体进行多重免疫荧光染色。图13：使用退火/去除经染料标记的寡核苷酸的循环对人扁桃体进行多重免疫荧光染色。定义除非本文另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料也可用于本专利技术的实践或试验中，但是描述的是优选方法和材料。本文提及的所有专利和出版物，包括在此类专利和出版物中公开的所有序列，都明确地通过引用并入。数字范围包括限定该范围的数字。除非另有说明，否则核酸以5'至3'方向从左向右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左向右书写。本文所提供的标题不是对本专利技术各个方面或实施方案的限制。因此，通过参考整个说明书，可以更全面地定义下面定义的术语。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，第2版，JohnWiley和Sons，NewYork(1994)，以及Hale&Markham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，N.Y.(1991)向技术人员提供本文使用的许多术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和便于参考，下面定义了某些术语。如本文所用，术语“目标生物学特征”是指可通过与捕获剂的结合来指示的细胞的任何部分。目标示例性生物学特征包括细胞壁、细胞核、细胞质、膜、角蛋白、肌纤维、胶原、骨、蛋白质、核酸(例如，mRNA或基因组DNA等)、脂肪等。目标生物学特征也可以通过免疫组织学方法指出，例如，与寡核苷酸连接的捕获剂。在这些实施方案中，捕获剂结合样品中的位点，例如蛋白质表位。示例性表位包括但不限于癌胚抗原(用于鉴定腺癌)、细胞角蛋白(用于鉴定癌但也可在一些肉瘤中表达)、CD15和CD30(对于霍奇金病)、甲胎蛋白(对于卵黄囊肿瘤和肝细胞癌)、CD117(对于胃肠道间质瘤)、CD10(对于肾细胞癌和急性淋巴细胞白血病)、前列腺特异性抗原(对于前列腺癌)、雌激素和孕酮(用于肿瘤鉴定)、CD20(用于鉴定B-细胞淋巴瘤)、CD3(用于鉴定T细胞淋巴瘤)。如本文所用，术语“复用”是指使用一种以上的标记同时或依次检测和测量生物活性物质。如本文所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并且为本领域技术人员所熟知。那些术语是指由一种或多种特异性结合抗原的多肽组成的蛋白质。一种形式的抗体构成抗体的基本结构单元。这种形式是四聚体，由两对相同的抗体链组成，每对具有一条轻链和一条重链。每对中，轻链和重链可变区一起负责结合抗原，恒定区负责抗体效应功能。公认的免疫球蛋白多肽包括κ和λ轻链及α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重链或其他物种中的等同物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包含在NH2末端的约110个氨基酸的可变区和COOH末端的κ或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分析样品的方法，其包括按顺序进行的以下步骤：(a)获得：i.多种捕获剂，每种捕获剂与不同的寡核苷酸连接；和ii.相应多个经标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针中的每一种仅与(a)(i)中所述寡核苷酸中的一种特异性杂交；(b)用(a)(i)的所述多种捕获剂标记样品；(c)使(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的第一亚组与所述样品特异性杂交，其中所述第一亚组中的探针可区别地标记，以产生经标记的探针/寡核苷酸双链体；(d)读取所述样品以获得显示步骤(c)中杂交的每个探针的结合模式的图像；(e)使步骤(c)中与所述样品相关的所述标记灭活或去除，使(b)的所述多种捕获剂及其相关的寡核苷酸仍然与所述样品结合；并且(f)用(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的不同亚组重复步骤(c)和(d)多次，除最后一次重复外，每次重复之后进行步骤(e)，以产生所述样品的多个图像，每个图像对应于(c)中使用的经标记的核酸探针亚组。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.27 US 62/367,5301.一种用于分析样品的方法，其包括按顺序进行的以下步骤：(a)获得：i.多种捕获剂，每种捕获剂与不同的寡核苷酸连接；和ii.相应多个经标记的核酸探针，其中所述经标记的核酸探针中的每一种仅与(a)(i)中所述寡核苷酸中的一种特异性杂交；(b)用(a)(i)的所述多种捕获剂标记样品；(c)使(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的第一亚组与所述样品特异性杂交，其中所述第一亚组中的探针可区别地标记，以产生经标记的探针/寡核苷酸双链体；(d)读取所述样品以获得显示步骤(c)中杂交的每个探针的结合模式的图像；(e)使步骤(c)中与所述样品相关的所述标记灭活或去除，使(b)的所述多种捕获剂及其相关的寡核苷酸仍然与所述样品结合；并且(f)用(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的不同亚组重复步骤(c)和(d)多次，除最后一次重复外，每次重复之后进行步骤(e)，以产生所述样品的多个图像，每个图像对应于(c)中使用的经标记的核酸探针亚组。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是平面细胞样品。3.根据先前任何权利要求所述的方法，其中(a)(i)的所述寡核苷酸长度为至少5个核苷酸。4.根据先前任何权利要求所述的方法，其中(a)(ii)的所述经标记的核酸探针长度为至少5个核苷酸。5.根据先前任何权利要求所述的方法，其中与(a)(i)的所述捕获剂连接的所述寡核苷酸的序列：i.比(a)(ii)的所述经标记的核酸探针的序列长并且ii.除了与(a)(ii)的单个标记的核酸探针互补的子序列外，在其他方面彼此相同。6.根据先前任何权利要求所述的方法，其中(c)的所述双链体的Tm为至少15℃。7.根据先前任何权利要求所述的方法，其中(c)的所述杂交持续约2分钟的时间期间。8.根据先前任何权利要求所述的方法，其中每个经标记的核酸探针具有选自SEQIDNO:1-47的序列或其互补序列。9.根据先前任何权利要求所述的方法，其中与捕获剂连接的每个寡核苷酸选自SEQIDNO:48-94或其互补序列。10.根据先前任何权利要求所述的方法，其中所述多种捕获剂是至少10种捕获剂。11.根据先前任何权利要求所述的方法，其中每个亚组独立地为2至4个经标记的核酸探针。12.根据先前任何权利要求所述的方法，其中所述探针在步骤(e)中使用甲酰胺去除。13.根据先前任何权利要求所述的方法，其中在步骤(e)中通过将样品在70％至90％甲酰胺中孵育至少1分钟的时间期间，随后洗涤而去除所述探针。14.根据先前任何权利要求所述的方法，其中步骤(f)包括重复步骤(c)和(d)2至20次。15.根据先前任何权利要求所述的方法，其还包括分析至少两个图像。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述分析包括比较或重叠至少两个图像。17.根据先前任何权利要求所述的方法，其还包括重叠所有图像，以产生显示所有所述捕获剂与所述样品的结合图案的图像。18.根据先前任何权利要求所述的方法，其中所述经标记的核酸探针经荧光标记。19.根据先前任何权利要求所述的方法，其中读取是通过荧光显微镜进行的。20.根据先前任何权利要求所述的方法，其中所述捕获试剂是抗体或适体。21.根据先前任何权利要求所述的方法，其中所述样品是经福尔马林固定、石蜡包...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·P·诺兰，N·萨穆希克，J·肯尼迪达林，Y·戈利采夫，
申请(专利权)人：斯坦福大学托管董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US