标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组CVA16疫苗外源基因拷贝数的方法及应用技术

本发明专利技术属于柯萨奇病毒A16型的制备技术领域，特别涉及标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组CVA16疫苗外源基因拷贝数的方法及应用。本发明专利技术的标准质粒主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中而构建而成，便于绘制出对应的标准曲线，以供重组CVA16疫苗外源基因的拷贝数采用Taqman探针‑荧光定量PCR的方法进行测定，能够简便快速、绝对定量、准确地对插入外源基因拷贝数进行分析，从而有效缩短了重组CVA16疫苗外源基因拷贝数测定的检测时间，便于多次重复操作。

Standard plasmid and preparation method, method and application of detecting copy number of recombinant CVA16 vaccine exogenous gene with this plasmid

The invention belongs to the technical field of preparation of coxsackievirus A16, in particular to the standard plasmid and its preparation method, the method and application of detecting the copy number of exogenous gene of recombinant CVA16 vaccine by using the plasmid. The standard plasmid of the present invention is mainly constructed by connecting the endogenous gene MOX, the exogenous gene P1 and the exogenous gene 3CD in the cloning vector after PCR amplification, which is convenient to draw the corresponding standard curve for determining the copy number of the exogenous gene of recombinant CVA16 vaccine by Taqman probe fluorescence quantitative PCR, and can be simple, rapid, absolute quantitative and accurate for inserting the exogenous gene. Because of the analysis of copy number, the detection time of foreign gene copy number of recombinant CVA16 vaccine was shortened effectively, and it was convenient for repeated operation.

【技术实现步骤摘要】
标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组CVA16疫苗外源基因拷贝数的方法及应用
本专利技术属于柯萨奇病毒A16型疫苗的制备
，特别涉及标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组CVA16疫苗外源基因拷贝数的方法及应用。
技术介绍
柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16，CVA16)属小RNA病毒科(Picornaviride)肠道病毒属(Enterovirus)，是手足口病(Hand-foot-and-mouthDisease，HFMD)的主要致病原之一，常与另一重要肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)交替或共同流行。CVA16多引起儿童的HFMD、疱疹性咽峡炎等自限性疾病，也可引起患者出现心肌炎、心包炎、无菌性脑膜炎、脑干脑炎和肺炎等重症并发症，甚至可导致死亡。随着EV71疫苗的问世，CVA16所引发的HFMD等疾病的流行更加引起人们的重视。现有一种重组柯萨奇病毒A16型疫苗(汉逊酵母)(简称重组CVA16疫苗)，该重组CVA16疫苗是基于汉逊酵母平台，将CVA16的基因片段P1和基因片段3CD通过重组技术随机整合于汉逊酵母的基因组中，形成重组基因组，其对应的汉逊酵母为重组汉逊酵母菌株。CVA16的基因片段P1和基因片段3CD作为外源基因在重组汉逊酵母菌株的细胞基质内大量表达P1前体蛋白和3CD酶，其中3CD酶能对P1前体蛋白进行切割得到结构蛋白VP1-VP4，随后自组装得到柯萨奇病毒A16型无核酸的病毒样颗粒，最后再经提取、纯化等操作将该病毒样颗粒从重组汉逊酵母菌株中分离出，以便于制成相应的病毒样颗粒疫苗，相对于传统的CVA16疫苗具有更加优良的免疫原性和生物安全性。在制备重组CVA16疫苗过程中，确定重组CVA16疫苗中外源基因P1和外源基因3CD的拷贝数对于细胞株的遗传稳定性及后期生产具有非常重要的意义。现有技术中，确定基因拷贝数的分析通常采用印迹杂交(Southernblot)，但该方法费时费力，所用DNA样品量很大，通过颜色深浅判断拷贝数，主观判断性强，不同的操作人员可能结果会有较大差异，并且探针是通过放射性标记的，对人体也有害。另一种确定拷贝数变化的分析则采用荧光定量PCR，该方法是一种基于PCR反应体系加入非特异性染料(SYBR-Green)或者荧光标记的特异性探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程，从而获得不同样品达到一定的荧光信号(荧光阈值)时所需要的循环数(Ct值)。采用该方法测定基因的拷贝数时，需要先其将已知浓度标准品的Ct值与其初始浓度的对数绘制标准曲线，再将待测样品的Ct值代入，便可计算待测样品模板的初始浓度，具体反应快速、重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰的特点，相对于印迹杂交法，能够较好的确定外源基因的拷贝数。由此可知，标准品是准确测定基因拷贝数的关键因素。然而，在实际操作过程中，由于CVA16的基因片段P1和基因片段3CD插入汉逊酵母基因组的具体数量为不定值，而在标准品的构建过程中需要明确外源基因P1和外源基因3CD具体插入汉逊酵母基因组中的数量，由此难以直接使用外源基因P1和外源基因3CD制备成相应的标准品。因此，急需研发一种标准品，使重组CVA16疫苗外源基因的拷贝数能使用荧光定量PCR加以测定，有效提高测定重组CVA16疫苗外源基因拷贝数的检测效率和精确度。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种标准质粒，其选取汉逊酵母基因组中的结构基因MOX作为单拷贝对照基因，构建出含有内源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD的标准质粒，以此能够明确外源基因P1和外源基因3CD插入汉逊酵母基因组中的具体数量，进而便于绘制出对应的标准曲线，以供重组CVA16疫苗外源基因的拷贝数采用荧光定量PCR的方法进行测定。本专利技术的第二个目的在于提供一种标准质粒的制备方法，其采用PCR扩增、双酶切以及转化培养的操作，便于标准质粒稳定的进行产业化，从而降低标准品的生产成本。本专利技术的第三个目的在于提供一种检测重组CVA16疫苗外源基因拷贝数的方法，其将本专利技术构建的标准质粒作为标准品，再采用荧光定量PCR法，以此绝对定量插入汉逊酵母基因组内的外源基因P1和外源基因3CD的拷贝数，有效节省了测定重组CVA16疫苗外源基因拷贝数的检测时间，具有操作简单，重复性好的特点。本专利技术的第四个目的在于提供一种检测重组CVA16疫苗外源基因拷贝数的方法的应用，其能够为菌株遗传稳定性研究和后续工艺研究提供有力的数据支撑，在基于汉逊酵母平台构建的重组CVA16疫苗外源基因拷贝数测定以及重组CVA16疫苗外源基因稳定遗传中得到良好的应用。为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种标准质粒，主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中而构建而成，其涉及的引物对如下：引物对1，MOX-F1：CCGGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCTMOX-R1：CGATTGGCACCACGTTGCTTGTTTCTCATA引物对2，CVA16-P1-F1：TATGAGAAACAAGCAACGTGGTGCCAATCGCVA16-P1-R1：GAACACAGATGGCTCTTCACGGTCTGGTCG引物对3，CVA16-3CD-F1：CGACCAGACCGTGAAGAGCCATCTGTGTTCCVA16-3CD-R1：GCGTCGACGGGTCACGTACTCGTCTGG。进一步地，所述内源基因MOX如SEQIDNo.1所示，所示外源基因P1如SEQIDNo.2所示，所示外源基因3CD如SEQIDNo.3所示。进一步地，所述克隆载体包括pUC系列载体、pET系列载体和pGEX系载体中的一种。进一步地，所述克隆载体为pUC18载体、pUC19载体、pET22b载体、pET28b载体、pET30a载体、pET32a载体、pGEX6P1载体中的一种。为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：一种标准质粒的制备方法，包括以下步骤：①、采用PCR扩增技术，以重组CVA16疫苗基因组为模板，分别制备出内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD，再以扩增出的内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD为模板，扩增出依次串联的基因片段CVA16-MOX-P1-3CD；②、采用双酶切技术，对克隆载体和步骤①扩增得到的基因片段CVA16-MOX-P1-3CD进行酶切，分别得到载体片段和目的片段；③、将步骤②制得的载体片段和目的片段进行连接，得到重组质粒；④、将步骤③得到的重组质粒转化至感受态细胞内，再将该感受态细胞涂布于对应的培养基中，于37℃恒温培养箱内培养，得到含有重组质粒的单克隆菌株；⑤、采用PCR/双酶切及测序手段对步骤③得到的单克隆菌株加以鉴定；⑥、经步骤④鉴定通过的单克隆菌株进行扩增，随后用质粒提取试剂盒对该单克隆菌株中的重组质粒加以提纯，得到标准质粒；⑦、将步骤⑥中提纯后的重组质粒进行浓度测定和质量控制，通过公式计算分别得到内源基因MOX、外源基因P1以及外源基因3CD的拷贝数。进一步地，步骤④中，所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞，其对应的培养基为LB培养基。为实现上述第三个目的，本专利技术提供了如本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种标准质粒，其特征在于，主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中而构建而成，其涉及的引物对如下：引物对1，MOX‑F1：CCGGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCTMOX‑R1：CGATTGGCACCACGTTGCTTGTTTCTCATA引物对2，CVA16‑P1‑F1：TATGAGAAACAAGCAACGTGGTGCCAATCGCVA16‑P1‑R1：GAACACAGATGGCTCTTCACGGTCTGGTCG引物对3，CVA16‑3CD‑F1：CGACCAGACCGTGAAGAGCCATCTGTGTTCCVA16‑3CD‑R1：GCGTCGACGGGTCACGTACTCGTCTGG。

【技术特征摘要】
1.一种标准质粒，其特征在于，主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中而构建而成，其涉及的引物对如下：引物对1，MOX-F1：CCGGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCTMOX-R1：CGATTGGCACCACGTTGCTTGTTTCTCATA引物对2，CVA16-P1-F1：TATGAGAAACAAGCAACGTGGTGCCAATCGCVA16-P1-R1：GAACACAGATGGCTCTTCACGGTCTGGTCG引物对3，CVA16-3CD-F1：CGACCAGACCGTGAAGAGCCATCTGTGTTCCVA16-3CD-R1：GCGTCGACGGGTCACGTACTCGTCTGG。2.根据权利要求1所述的标准质粒，其特征在于，所述内源基因MOX如SEQIDNo.1所示，所示外源基因P1如SEQIDNo.2所示，所示外源基因3CD如SEQIDNo.3所示。3.根据权利要求1所述的标准质粒，其特征在于，所述克隆载体包括pUC系列载体、pET系列载体和pGEX系载体中的一种。4.根据权利要求3所述的标准质粒，其特征在于，所述克隆载体为pUC18载体、pUC19载体、pET22b载体、pET28b载体、pET30a载体、pET32a载体、pGEX6P1载体中的一种。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的标准质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①、采用PCR扩增技术，以重组CVA16疫苗基因组为模板，分别制备出内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD，再以扩增出的内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD为模板，扩增出依次串联的基因片段CVA16-MOX-P1-3CD；②、采用双酶切技术，对克隆载体和步骤①扩增得到的基因片段CVA16-MOX-P1-3CD进行酶切，分别得到载体片段和目的片段；③、将步骤②制得的载体片段和目的片段进行连接，得到重组质粒；④、将步骤③得到的重组质粒转化至感受态细胞内，再将该感受态细胞涂布于对应的培养基中，于37℃恒温培养箱内培养，得到含有重组质粒的单克隆菌株；⑤、采用PCR/双酶切及测序手段对步骤③得到的单克隆菌株加以鉴定；⑥、经步骤④鉴定通过的单克隆菌株进行扩增，随后用质粒提取试剂盒对该单克隆菌株中的重组质粒加以提纯，得到标准质粒；⑦、将步骤⑥中提纯后的重组质粒进行浓度测定和质量控制，通过公式计算分别得到内源基因MOX、外源基因P1以及外源基因3CD的拷贝数。6.根据权利要求5所述的标准质粒的制备方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张改梅，顾美荣，陈可芝，刘建凯，朱征宇，甘建辉，郑海发，
申请(专利权)人：深圳鑫泰康生物科技有限公司，北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44