一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv-ΔgC及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv‑ΔgC及其构建方法。本发明专利技术利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPKan‑S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经过细胞内自发同源重组方法缺失MiniF元件，首次完成了无MiniF元件残留的鸭瘟病毒无痕缺失株的构建。本发明专利技术技术方案解决了缺失鸭瘟病毒基因时在鸭瘟病毒基因组上残留MiniF元件的问题，为准确探究鸭瘟病毒基因功能及减毒活疫苗的构建提供了充分的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPVCHv-ΔgC及其构建方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPVCHv-ΔgC及其构建方法。
技术介绍
细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome，BAC)是一种以F质粒为基础构成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kd左右大小的DNA片段，最多可保存300kd个碱基对，该质粒主要包括oris，repE(控制F质粒复制)和parA，parB(控制拷贝数)等构成，以BAC为基础克隆的载体成嵌合体的效率较低，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌体内，易于分辨和分离纯化，目前主要用于大片段基因组文库的构建和大的基因簇的相关研究。将完整病毒基因组DNA分子插入BAC载体，利用该载体编码的最小生育力因子复制子(Minimalfertilityfactorreplicon，Mini-F)获得分子克隆化病毒，并结合大肠杆菌中成熟的基因定位修饰技术，从而实现在原核系统中病毒基因的缺失及外源基因的插入。目前较为常用的大肠杆菌基因定位修饰技术主要包括Red/ET介导的同源重组技术、RecA蛋白介导的同源重组技术、Cre/loxP介导的同源重组技术以及Tn转座子介导的随机插入和突变技术。利用分子克隆化技术手段现已获得成熟的细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台，同时利用大肠杆菌基因定位修饰Red/ET介导的同源重组技术可在细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台上进行鸭瘟病毒基因的缺失和外源基因的插入，该成果极大的推动了鸭瘟病毒基因功能的研究进程。MiniF元件作为维持BAC载体复制的最小生育力因子复制子，主要由调控BAC复制起点(oriS)的repE、repF基因、调控复制子分配的sopA、sopB基因以及编码着丝粒区域的sopC基因构成。MiniF元件加入了抗性筛选基因和荧光标记基因，以完成细菌抗性筛选及BAC标记筛选，。MiniF元件插入病毒基因组，增加基因组长度，对病毒复制产生不确定影响。同时MiniF元件作为细菌序列在病毒基因组上残留，不利于减毒活疫苗的开发和许可。因此获得去除MiniF元件缺失株，已成为探究鸭瘟病毒基因缺失方法的重点。鸭瘟(DuckPlague，DP)是由α-疱疹病毒亚科中鸭瘟病毒(DuckPlaguevirus，DPV)引起的鸭、鹅等水禽的急性接触性高度致死性传染病。该病首先由荷兰报道，随即在我国华南、华中和华东等养鸭业较为发达的地区流行，给我国的养鸭业造成了严重的经济损失。因此深入了解鸭瘟病毒基因功能、加强对鸭瘟疫病的研究对确保我国养鸭业健康、可持续发展尤为重要。鸭瘟病毒DPV-CHv株基因组DNA全长162175bp，包含78个开放阅读框，可编码参与鸭瘟病毒生命周期的结构蛋白和功能蛋白，其中结构蛋白主要包括构成病毒的囊膜、间层、衣壳及DNA结合蛋白。囊膜蛋白为糖基化蛋白，包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、gN十二种。疱疹病毒囊膜糖蛋白在病毒的结构、功能和毒力等方面发挥着重要作用。因此探究囊膜糖蛋白在鸭瘟病毒生命周期中的作用对深入探究鸭瘟病毒基因功能及开展鸭瘟疫病防治工作至关重要。现有技术中利用以BAC为平台分子克隆化病毒的技术，将鸭瘟病毒基因组重组到含有BAC的病毒转移载体中，通过将长达162kb左右的鸭瘟病毒中国强毒株(DPVCHv)基因组克隆到细菌人工染色体(BAC)中，电转化大肠杆菌DH10B后获得的阳性克隆提取质粒后转染鸭胚成纤维细胞(DEF)，拯救出能在宿主细胞DEF上产生绿色荧光和空斑的细菌人工染色体重组鸭瘟病毒DEVCHv-BAC-G所获重组病毒DEVCHv-BAC-G，能够以病毒形式在细胞内生存，亦可以质粒的形式在大肠杆菌内复制，使得我们可以运用大肠杆菌系统成熟的遗传操作手段对DPVCHv基因组的任意位置进行修饰、改造、研究。但利用Red/ET修饰技术在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上对鸭瘟病毒基因缺失后，会残留MiniF元件。MiniF元件的残留对基因功能的探究、减毒活疫苗的开发和许可存在影响。
技术实现思路
针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPVCHv-ΔgC及其构建方法，可有效解决残留MiniF元件的问题。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPVCHv-ΔgC的构建方法，包括以下步骤：(1)以pKD4质粒为扩增模板，构建△gC扩kana上游引物和构建△gC扩kana下游引物，通过PCR方法扩增包含两侧带有gC基因同源臂及FRT序列的kana抗性基因片段，切胶回收，获得DPVgC左臂-FRT-kana-FRT-gC右臂片段；(2)诱导含有pKD46和DPVCHv-BAC-G克隆菌DH10BRED重组系统表达；并制备含有pKD46和DPVCHv-BAC-G的DH10B阳性克隆菌感受态；电转化切胶回收DPVgC左臂-FRT-kana-FRT-gC右臂打靶片段进入含有pKD46和感染性克隆质粒的感受态中；筛选阳性克隆子，利用gC基因鉴定引物gC-R；gC-F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPVCHv-BAC-G△gC-kana；(3)去除阳性克隆子DPVCHv-BAC-G△gC-kana中的kana抗性基因，利用gC基因鉴定引物gC-R；gC-F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPVCHv-BAC-G△gC；(4)提取重组DPVCHv-BAC-G△gC质粒，将其电转化进入GS1783感受态中，获得阳性克隆子GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC，并制备GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC感受态；(5)以pEPKan-S为模板，GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切胶回收获得I_SceI-Kana-MiniF片段；(6)以CHv基因组为模板，CHv-UL23-F和CHv-UL23-R为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收，获得UL23-MiniF片段；(7)以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作为引物进行PCR扩增，获得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；(8)将I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段转化到GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC-UL23-Kana；(9)将阳性克隆子GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC-UL23-Kana中的I_SceI-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPV CHv‑ΔgC的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pKD4质粒为扩增模板，构建△gC扩kana上游引物和构建△gC扩kana下游引物，通过PCR方法扩增包含两侧带有gC基因同源臂及FRT序列的kana抗性基因片段，切胶回收，获得DPV gC左臂‑FRT‑kana‑FRT‑gC右臂片段；(2)诱导含有pKD46和DPV CHv‑BAC‑G克隆菌DH10B RED重组系统表达；并制备含有pKD46和DPV CHv‑BAC‑G的DH10B阳性克隆菌感受态；电转化切胶回收DPV gC左臂‑FRT‑kana‑FRT‑gC右臂打靶片段进入含有pKD46和感染性克隆质粒的感受态中；筛选阳性克隆子，利用gC基因鉴定引物gC‑R；gC‑F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPV CHv‑BAC‑G△gC‑kana；(3)去除阳性克隆子DPV CHv‑BAC‑G△gC‑kana中的kana抗性基因，利用gC基因鉴定引物gC‑R；gC‑F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPV CHv‑BAC‑G△gC；(4)提取重组DPV CHv‑BAC‑G△gC质粒，将其电转化进入GS1783感受态中，获得阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC，并制备GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC感受态；(5)以pEPKan‑S为模板，GS1783‑MiniF‑F和GS1783‑MiniF‑R为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI‑Kana‑MiniF，切胶回收获得I_SceI‑Kana‑MiniF片段；(6)以CHv基因组为模板，CHv‑UL23‑F和CHv‑UL23‑R为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI‑Kana‑MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收，获得UL23‑MiniF片段；(7)以I_SceI‑Kana‑MiniF片段和UL23‑MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783‑MiniF‑F和CHv‑UL23‑R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI‑Kana‑MiniF‑UL23打靶片段；(8)将I_SceI‑Kana‑MiniF‑UL23打靶片段转化到GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23‑Kana；(9)将阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23‑Kana中的I_SceI‑Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23；(10)从阳性克隆子GS1783‑DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23中提取DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23质粒，用DPV CHv‑BAC‑G△gC‑UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得去除MiniF元件的DPV CHv‑△gC。...

【技术特征摘要】
1.一种鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPVCHv-ΔgC的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以pKD4质粒为扩增模板，构建△gC扩kana上游引物和构建△gC扩kana下游引物，通过PCR方法扩增包含两侧带有gC基因同源臂及FRT序列的kana抗性基因片段，切胶回收，获得DPVgC左臂-FRT-kana-FRT-gC右臂片段；(2)诱导含有pKD46和DPVCHv-BAC-G克隆菌DH10BRED重组系统表达；并制备含有pKD46和DPVCHv-BAC-G的DH10B阳性克隆菌感受态；电转化切胶回收DPVgC左臂-FRT-kana-FRT-gC右臂打靶片段进入含有pKD46和感染性克隆质粒的感受态中；筛选阳性克隆子，利用gC基因鉴定引物gC-R；gC-F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPVCHv-BAC-G△gC-kana；(3)去除阳性克隆子DPVCHv-BAC-G△gC-kana中的kana抗性基因，利用gC基因鉴定引物gC-R；gC-F进行PCR鉴定，获得阳性克隆子DPVCHv-BAC-G△gC；(4)提取重组DPVCHv-BAC-G△gC质粒，将其电转化进入GS1783感受态中，获得阳性克隆子GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC，并制备GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC感受态；(5)以pEPKan-S为模板，GS1783-MiniF-F和GS1783-MiniF-R为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段、位于MiniF元件ori2基因下游240bp处和位于MiniF元件ori2基因下游290bp处的同源臂片段I_SceI-Kana-MiniF，切胶回收获得I_SceI-Kana-MiniF片段；(6)以CHv基因组为模板，CHv-UL23-F和CHv-UL23-R为引物，通过PCR方法扩增包含UL23基因、I_SceI-Kana-MiniF下游同源臂重叠25bp和位于MiniF元件ori2基因下游180bp处的同源臂片段，切胶回收，获得UL23-MiniF片段；(7)以I_SceI-Kana-MiniF片段和UL23-MiniF片段为模板，进行PCR融合反应，然后以融合片段为模板，以GS1783-MiniF-F和CHv-UL23-R作为引物进行PCR扩增获得I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段；(8)将I_SceI-Kana-MiniF-UL23打靶片段转化到GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC感受态中，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC-UL23-Kana；(9)将阳性克隆子GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC-UL23-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC-UL23；(10)从阳性克隆子GS1783-DPVCHv-BAC-G△gC-UL23中提取DPVCHv-BAC-G△gC-UL23质粒，用DPVCHv-BAC-G△gC-UL23质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得去除MiniF元件的DPVCHv-△gC。2.根据权利要求1中所述鸭瘟病毒去MiniF元件gC基因缺失株DPVCHv-ΔgC的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增体系为：ddH2O14μL、MaxDNAPolymerase20μL、上游引物2μL、下游引物2μL、模板2μL；PCR扩增条件为：98℃预变性1min、94℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：程安春，周晓凤，汪铭书，刘田，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51