鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv‑BAC‑G‑gEΔET及其构建方法。本发明专利技术利用GS1783大肠杆菌及pEPkan‑S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经同源重组缺失鸭瘟病毒gE基因ET区域，首次完成了无外源碱基残留的鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株的构建。本发明专利技术技术方案解决了缺失鸭瘟病毒基因时在缺失位点残留碱基的问题，为准确探究鸭瘟病毒基因功能及减毒活疫苗的构建提供了充分的技术支持。

【技术实现步骤摘要】
鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET及其构建方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET及其构建方法。
技术介绍
细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)是一种新发展起来的DNA载体系统，它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点，在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用。将完整病毒基因组DNA分子插入BAC载体，利用该载体编码的最小生育力因子复制子(Minimalfertilityfactorreplicon，Mini-F)获得分子克隆化病毒，并结合大肠杆菌中成熟的基因定位修饰技术，从而实现在原核系统中病毒基因的缺失及外源基因的插入。目前较为常用的大肠杆菌基因定位修饰技术主要包括Red/ET介导的同源重组技术、RecA蛋白介导的同源重组技术、Cre/loxP介导的同源重组技术以及Tn转座子介导的随机插入和突变技术。利用分子克隆化技术手段现已获得成熟的细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台，同时利用大肠杆菌基因定位修饰Red/ET介导的同源重组技术可在细菌人工染色体鸭瘟病毒拯救系统平台上进行鸭瘟病毒基因的缺失和外源基因的插入，该成果极大的推动了鸭瘟病毒基因功能的研究进程。Red/ET介导的同源重组技术是基于λ-噬菌体Red操纵子(Redα/Redβ/Redγ)和Rac噬菌体RecE/RecT同源重组酶的同源重组打靶技术。该技术操作简单、快速、高效，广泛应用于基因缺失、突变工作。但是利用该操作技术进行基因缺失、突变会在缺失或突变位点残留约80bp左右外源碱基序列(FRT位点)，该位点的残留将影响基因功能的准确分析。鸭瘟(DuckPlague，DP)是由α-疱疹病毒亚科中鸭瘟病毒(DuckPlaguevirus,DPV)引起的鸭、鹅等水禽的急性接触性高度致死性传染病。该病首先由荷兰报道，随即在我国华南、华中和华东等养鸭业较为发达的地区流行，给我国的养鸭业造成了严重的经济损失。因此深入了解鸭瘟病毒基因功能、加强对鸭瘟疫病的研究对确保我国养鸭业健康、可持续发展尤为重要。鸭瘟病毒DPV-CHv株基因组DNA全长162175bp，包含78个开放阅读框，可编码参与鸭瘟病毒生命周期的结构蛋白和非结构蛋白，其中结构蛋白主要包括衣壳蛋白、皮层蛋白和囊膜蛋白。囊膜蛋白为糖基化蛋白，包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、gN十二种。糖蛋白具有介导病毒吸附、进入敏感细胞以及促进病毒在细胞间传播的功能，同时携带抗原决定簇，可诱导动物机体免疫系统对病毒的识别并造成组织的病理损伤，因此探究囊膜糖蛋白在鸭瘟病毒生命周期中的作用对深入探究鸭瘟病毒基因功能及开展鸭瘟疫病防治工作至关重要。现有技术中利用以BAC为平台分子克隆化病毒的技术，将鸭瘟病毒基因组重组到含有BAC的病毒转移载体中，构建细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台DPVCHv-BAC-G。同时结合Red/ET修饰技术，在原核系统中通过成熟的基因操作手段完成鸭瘟病毒基因缺失和外源基因插入。但利用Red/ET修饰技术在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上对鸭瘟病毒基因缺失后，会在缺失基因处残余两处FRT位点。FRT外源位点的残留对基因功能的探究、减毒活疫苗的开发和许可存在影响。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET及其构建方法，该构建方法可有效解决缺失鸭瘟病毒基因时在缺失位点残留碱基的问题。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET，其构建方法包括以下步骤：(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；(2)以pEPkan-S为模板，以GS1783-BAC-gEΔET-F和GS1783-BAC-gEΔET-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及gE基因ET区域上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-ET，切胶回收获得I_SceI-Kana-ET片段；(3)将I_SceI-Kana-ET片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ET-Kana；(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ET-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔET；(5)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔET中提取pBAC-DPV-gEΔET质粒，将pBAC-DPV-gEΔET质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET。进一步地，步骤(2)中引物序列为：GS1783-BAC-gEΔET-F:5’-CTGCCGGCCAGACTACGGAACCTCAACAATTGGTACGATGtagggataacagggtaatcgattt-3’。；GS1783-BAC-gEΔET-R:5’-TAATAGTCACGACCCCTAGTACTCCGAGACCGACTACAAACATCGTACCAATTGTTGAGGTTCCGTAGTCTGGCCGGCAGgccagtgttacaaccaat-3’。进一步地，步骤(2)中PCR扩增体系为：ddH2O22μl、MaxDNAPolymerase25μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板1μl；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸5s，共30个循环，最后72℃延伸10min。本专利技术提供的鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET及其构建方法，具有以下有益效果：为获得无外源碱基残留的鸭瘟病毒基因缺失株，本专利技术在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台的基础上，利用Red-based修饰技术，即利用含有可编码Red操纵子和I_SceI酶基因序列的GS1783大肠杆菌菌株及含有编码卡纳抗性及I_SceI酶切位点的质粒pEPkan-S，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经同源重组缺失鸭瘟病毒gE基因ET区域，首次完成了无外源碱基残留的鸭瘟病毒无痕缺失株的构建。本专利技术技术方案解决了缺失鸭瘟病毒基因时在缺失位点残留碱基的问题，为准确探究鸭瘟病毒基因功能及减毒活疫苗的构建提供了充分的技术支持。附图说明图1为pEPkan-S质粒图谱。图2为利用Red-Based修饰技术在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上进行基因缺失的操作流程图。图3为CHv-BAC-G-gEΔET无痕缺失病毒株病毒拯救后荧光斑图片。图4为CHv-BAC-G-gEΔET无痕缺失病毒株空斑形成图片。具体实施方式鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET，构建过程所用材料及试剂如下：1、实验材料(1)细胞、菌株、病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv‑BAC‑G‑gEΔET的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pBAC‑DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783‑pBAC‑DPV菌株，然后制备GS1783‑pBAC‑DPV感受态；(2)以pEPkan‑S为模板，以GS1783‑BAC‑gEΔET‑F和GS1783‑BAC‑gEΔET‑R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及gE基因ET区域上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI‑Kana‑ET，切胶回收获得I_SceI‑Kana‑ET片段；(3)将I_SceI‑Kana‑ET片段转化到GS1783‑pBAC‑DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ET‑Kana；(4)将阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ET‑Kana中的I_SceI‑Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑gEΔET；(5)从阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑gEΔET中提取pBAC‑DPV‑gEΔET质粒，将pBAC‑DPV‑gEΔET质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得gE基因ET区域无痕缺失株CHv‑BAC‑G‑gEΔET。...

【技术特征摘要】
1.鸭瘟病毒gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；(2)以pEPkan-S为模板，以GS1783-BAC-gEΔET-F和GS1783-BAC-gEΔET-R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及gE基因ET区域上游和下游各40bp同源臂的打靶片段I_SceI-Kana-ET，切胶回收获得I_SceI-Kana-ET片段；(3)将I_SceI-Kana-ET片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ET-Kana；(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ET-Kana中的I_SceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔET；(5)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-gEΔET中提取pBAC-DPV-gEΔET质粒，将pBAC-DPV-gEΔET质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得gE基因ET区域无痕缺失株CHv-BAC-G-gEΔET。2.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪铭书，刘田，黄雅琳，程安春，秦旭东，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51