标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法及应用技术

本发明专利技术属于肠道病毒71型的制备技术领域，特别涉及标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法及应用。本发明专利技术的标准质粒主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中而构建而成，便于绘制出对应的标准曲线，以供重组EV71疫苗外源基因的拷贝数采用Taqman探针‑荧光定量PCR的方法进行测定，能够简便快速、绝对定量、准确地对插入外源基因拷贝数进行分析，从而有效缩短了重组EV71疫苗外源基因拷贝数测定的检测时间，便于多次重复操作。

Standard plasmid and its preparation method, method and application of detecting copy number of recombinant EV71 vaccine exogenous gene with this plasmid

The invention belongs to the technical field of preparation of enterovirus 71, in particular to the standard plasmid and its preparation method, the method for detecting the copy number of foreign gene of recombinant EV71 vaccine by using the plasmid and its application. The standard plasmid of the present invention is mainly constructed by connecting the endogenous gene MOX, the exogenous gene P1 and the exogenous gene 3CD in the cloning vector after PCR amplification. It is convenient to draw the corresponding standard curve for the determination of the copy number of the exogenous gene of recombinant EV71 vaccine by Taqman probe fluorescence quantitative PCR. The method can be simple, rapid, absolute quantitative and accurate for the insertion of the exogenous gene. Because of the analysis of copy number, the detection time of recombinant EV71 vaccine exogenous gene copy number was shortened effectively, and it was convenient for repeated operation.

【技术实现步骤摘要】
标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法及应用
本专利技术属于肠道病毒71型疫苗的制备
，特别涉及标准质粒及制备方法、使用该质粒检测重组EV71疫苗外源基因拷贝数的方法及应用。
技术介绍
手足口病(HFMD)是肠道病毒引起的常见传染病之一。5岁以下婴幼儿发病率最高，每年6～8月为流行季节，传播途径主要是呼吸道和经口感染。本病传染性强，传播途径广，传播快，流行强度大，在短期内即可造成大流行。肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16，CVA16)是本病的主要致病原。较CVA16而言，EV71则凶险得多，90％以上的重症病例和死亡病例都是由EV71病毒引起。现有一种重组肠道病毒71型疫苗(汉逊酵母)(简称重组EV71疫苗)，该重组EV71疫苗是基于汉逊酵母平台，将EV71的基因片段P1和基因片段3CD通过重组技术随机整合于汉逊酵母的基因组中，形成重组基因组，其对应的汉逊酵母为重组汉逊酵母菌株。EV71的基因片段P1和基因片段3CD作为外源基因在重组汉逊酵母菌株的细胞基质内大量表达P1前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种标准质粒，其特征在于，主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中而构建而成，其涉及的引物对如下：引物对1，MOX‑F1：AATGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCTMOX‑R1：GATTGGCACCACCAGTGCTTGTTTCTCATA引物对2，EV71‑P1‑F1：TGAGAAACAAGCACTGGTGGTGCCAATCTCEV71‑P1‑R1：AACTTCTCGTTGGGGTTGGGTGGAAGTTTG引物对3，EV71‑3CD‑F1：TCCACCCAACCCCAACGAGAAGTTCAGAGAEV71‑3CD‑R1：AATGTC...

【技术特征摘要】
1.一种标准质粒，其特征在于，主要由内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD经PCR扩增后连接于克隆载体中而构建而成，其涉及的引物对如下：引物对1，MOX-F1：AATGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCTMOX-R1：GATTGGCACCACCAGTGCTTGTTTCTCATA引物对2，EV71-P1-F1：TGAGAAACAAGCACTGGTGGTGCCAATCTCEV71-P1-R1：AACTTCTCGTTGGGGTTGGGTGGAAGTTTG引物对3，EV71-3CD-F1：TCCACCCAACCCCAACGAGAAGTTCAGAGAEV71-3CD-R1：AATGTCGACCTTACCAGACAGGTTCAGG。2.根据权利要求1所述的标准质粒，其特征在于，所述内源基因MOX如SEQIDNo.1所示，所示外源基因P1如SEQIDNo.2所示，所示外源基因3CD如SEQIDNo.3所示。3.根据权利要求1所述的标准质粒，其特征在于，所述克隆载体包括pUC系列载体、pET系列载体和pGEX系载体中的一种。4.根据权利要求3所述的标准质粒，其特征在于，所述克隆载体为pUC18载体、pUC19载体、pET22b载体、pET28b载体、pET30a载体、pET32a载体、pGEX6P1载体中的一种。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的标准质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①、采用PCR扩增技术，以重组EV71疫苗基因组为模板，分别制备出内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD，再以扩增出的内源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD为模板，扩增出依次串联的基因片段EV71-MOX-P1-3CD；②、采用双酶切技术，对克隆载体和步骤①扩增得到的基因片段EV71-MOX-P1-3CD进行酶切，分别得到载体片段和目的片段；③、将步骤②制得的载体片段和目的片段进行连接，得到重组质粒；④、将步骤③得到的重组质粒转化至感受态细胞内，再将该感受态细胞涂布于对应的培养基中，于37℃恒温培养箱内培养，得到含有重组质粒的单克隆菌株；⑤、采用PCR/双酶切及测序手段对步骤③得到的单克隆菌株加以鉴定；⑥、经步骤④鉴定通过的单克隆菌株进行扩增，随后用质粒提取试剂盒对该单克隆菌株中的重组质粒加以提纯，得到标准质粒；⑦、将步骤⑥中提纯后的重组质粒进行浓度测定和质量控制，通过公式计算分别得到内源基因MOX、外源基因P1以及外源基因3CD的拷贝数。6.根据权利要求5所述的标准质粒的制备方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张改梅，顾美荣，刘建凯，朱征宇，甘建辉，郑海发，
申请(专利权)人：深圳鑫泰康生物科技有限公司，北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44