鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法。本发明专利技术利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPkan‑S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组分别缺失鸭瘟病毒US1单、双拷贝基因，首次完成了该基因的无痕缺失病毒株构建，并探究了该基因对病毒复制的影响。本发明专利技术技术方案为准确探究鸭瘟病毒US1基因功能奠定了基础，以期对鸭瘟病毒分子生物学研究提供参考。

【技术实现步骤摘要】
鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种鸭瘟病毒US1基因单、双拷贝无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1、CHv-BAC-G-2ΔUS1及其构建方法。
技术介绍
细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)是基于大肠杆菌(E.coli)F因子构建的质粒载体。F因子又称F质粒，是一种“性质粒”，能将宿主染色体基因转移至另一宿主细胞，天然F因子是超螺旋闭环DNA分子，大小约100kb，编码约100个蛋白质。BAC可容纳100～300kb大小外源插入片段，并能稳定遗传，克隆至BAC载体的基因组在传代中不会出现在酵母人工染色体(YAC)载体中那样易发生缺失、重组和嵌合现象，并且可以在E.coli中进行人工遗传操作，方便又安全。鸭瘟(Duckplague)是由鸭瘟病毒(Duckplaguevirus,DPV)又名鸭肠炎病毒(Duckenteritisvirus,DEV)引起，可感染鸭、鹅和天鹅等其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性和致死性的传染病。鸭瘟于1957年首次在我国被报道，并迅速流行，迄今为止，给养鸭业带来巨大经济损失。鸭瘟病毒属于疱疹病毒科成员，其全基因组大小约为160kb，其由一个独特长区(uniquelong,UL)、一个独特短区(uniqueshort，US)和两段反向重复序列(IRSandTRS)组成。DPV基因组与其他α-疱疹病毒相似，由UL区和US区组成，中间有IR区相隔，两端有TR区相连，即UL-IRS-US-TRS。在其他疱疹病毒中DPVUS1编码的ICP22蛋白同源物已有大量报道。以HSV-1为例，ICP22是一个广泛的翻译后修饰蛋白，是病毒最重要的即刻早期蛋白之一，在病毒复制和转录调控过程中起重要作用，是决定病毒是否进入潜伏感染或裂解感染的关键蛋白。VZV中同源物OFF63也是该病毒有效建立潜伏期的关键因素。因此，HSV-1ICP22和VZVORF63在感染过程中所起的重要作用，提示DPVICP22在感染过程中可能起着类似的作用。目前尚不清楚DPVICP22在DPV生命周期中的真正生物学功能，对这些方面的研究必须等待进一步研究其在病毒复制中的作用。拟通过构建鸭瘟病毒US1基因缺失株来为鸭瘟病毒分子生物学研究提供参考。因此，如何构建鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株是目前主要解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株及其构建方法，本专利技术利用GS1783大肠杆菌菌株及pEPkan-S质粒，在细菌人工染色体重组鸭瘟病毒拯救系统平台上经两次同源重组分别缺失鸭瘟病毒US1单、双拷贝基因，首次完成了该基因的无痕缺失病毒株构建。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种鸭瘟病毒US1单拷贝基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1，其构建方法包括以下步骤：(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1；(5)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1中提取pBAC-DPV-ΔUS1质粒，将pBAC-DPV-ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1。进一步地，步骤(2)中引物序列为：1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；1603R:5’-AGGTTAATACGCGCTTGCAGCATATATCGCGACAGGTTTAGTCTATCGCAGTTCTGTAAACGAGAGCCTTTTATATATTGttaaccaattctgattag-3’。进一步地，步骤(2)中PCR扩增体系为：ddH2O7μL、MaxDNAPolymerase10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。进一步地，步骤(3)中鉴定时所用引物序列为：1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；1604R1：5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’。一种鸭瘟病毒US1双拷贝基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1，其构建方法包括以下步骤：(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1，然后制备GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1感受态；(5)以pEPkan-S为模板，以1808F、1808R作为引物，通过PCR方法扩增包含I_sceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上下游各40bp的内部同源打靶片段1808，切胶回收获得1808片段；(6)将1808片段转化到GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1感受态中，经筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana；(7)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1；(8)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-2ΔUS1中提取pBAC-DPV-2ΔUS1质粒，将pBAC-DPV-2ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1。进一步地，步骤(2)中引物序列为：1603F:5’-CAATAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv‑BAC‑G‑ΔUS1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pBAC‑DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783‑pBAC‑DPV菌株，然后制备GS1783‑pBAC‑DPV感受态；(2)以pEPkan‑S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I‑SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；(3)将1603片段转化到GS1783‑pBAC‑DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔUS1‑Kana；(4)将阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔUS1‑Kana中的I_sceI‑Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔUS1；(5)从阳性克隆子GS1783‑pBAC‑DPV‑ΔUS1中提取pBAC‑DPV‑ΔUS1质粒，将pBAC‑DPV‑ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv‑BAC‑G‑ΔUS1。...

【技术特征摘要】
1.鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1；(5)从阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1中提取pBAC-DPV-ΔUS1质粒，将pBAC-DPV-ΔUS1质粒转染DEF细胞，通过克隆筛选，获得US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1。2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(2)中引物序列为：1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；1603R:5’-AGGTTAATACGCGCTTGCAGCATATATCGCGACAGGTTTAGTCTATCGCAGTTCTGTAAACGAGAGCCTTTTATATATTGttaaccaattctgattag-3’。3.根据权利要求1或2所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增体系为：ddH2O7μL、MaxDNAPolymerase10μL、上游引物1μL、下游引物1μL、模板1μL；PCR扩增条件为：98℃预变性2min、98℃变性15s、55℃退火15s、72℃延伸10s，共30个循环，最后72℃延伸7min。4.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1的构建方法，其特征在于，步骤(3)中鉴定时所用引物序列为：1603F:5’-CAATATATAAAAGGCTCTCGTTTACAGAACTGCGATAGACaggatgacgacgataagtaggg-3’；1604R1：5’-GCGGTGTTTATTGACATCA-3’。5.采用权利要求1-4任一项所述的方法构建得到的鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-ΔUS1。6.鸭瘟病毒US1基因无痕缺失病毒株CHv-BAC-G-2ΔUS1的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pBAC-DPV质粒转化到GS1783大肠杆菌感受态中，获得GS1783-pBAC-DPV菌株，然后制备GS1783-pBAC-DPV感受态；(2)以pEPkan-S为模板，以1603F、1603R作为引物，通过PCR方法扩增包含I-SceI酶切位点和Kana元件的碱基片段以及US1基因上、下游各40bp同源臂的打靶片段1603，切胶回收获得1603片段；(3)将1603片段转化到GS1783-pBAC-DPV感受态中，筛选、鉴定，获得阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana；(4)将阳性克隆子GS1783-pBAC-DPV-ΔUS1-Kana中的I_sceI-Kana片段去掉，经抗生素筛选和PCR鉴定，获得阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴英，李阳光，程安春，汪铭书，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51