重组CA16病毒样颗粒的纯化、在疫苗中的应用及疫苗制造技术

本发明专利技术提供重组CA16病毒样颗粒的纯化方法、在疫苗中的应用及疫苗。通过将重组表达的工程菌高密度发酵培养和甲醇诱导表达CA16类病毒颗粒蛋白，离心收集菌体进行高压均浆破碎，上清液经超滤、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析等纯化后获得。本发明专利技术提供的CA16类病毒颗粒疫苗具有良好的免疫原性、安全性、免疫特性和生物学活性，工艺简单，纯化采用层析方法，相比密度梯度离心，更利于线性放大，并可以大规模制备和纯化，并可得到高纯度（大于99%）的VLP原液，可用于制备预防CA16感染的疫苗，具有较好的经济价值和应用前景。

Purification, Application and Vaccine of Recombinant CA16 Virus-like Particles

The invention provides a purification method of recombinant CA16 virus-like particles, application in vaccines and vaccines. The recombinant engineering bacteria were cultured in high density fermentation and induced to express CA16 virus granule protein by methanol. The bacteria were collected by centrifugation and homogenized under high pressure. The supernatant was purified by ultrafiltration, ion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography and molecular sieve chromatography. The CA16 virus granular vaccine provided by the invention has good immunogenicity, safety, immune characteristics and biological activity, simple process, and purification by chromatography. Compared with density gradient centrifugation, it is more conducive to linear amplification, and can be prepared and purified on a large scale. The high purity (over 99%) VLP raw solution can be obtained, which can be used to prepare vaccine against CA16 infection. Better economic value and application prospect.

【技术实现步骤摘要】
重组CA16病毒样颗粒的纯化、在疫苗中的应用及疫苗
本专利技术涉及生物制品领域，具体地，涉及一种重组CA16病毒样颗粒的纯化方法以及利用纯化后的CA16病毒样颗粒制备的疫苗。
技术介绍
手足口病(HFMD)是儿童常见传染病，以手、足皮肤疱疹和口腔黏膜疹为主要临床表现，绝大多数病例为自限性疾病，5-7天自行缓解，极少部分迅速发展为重症，少数病例可出现无菌性脑膜脑炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿、心脏损害等。手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。1957年，首次在新西兰爆发。1958年加拿大Robinson从患者粪便中和咽拭中分离出柯萨奇病毒A组16型(CA16)。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继爆发以中枢神经系统为主要临床特征的CA16流行，仅保加利亚报告750例发病，149人致瘫，44人死亡。英国1994年4季度爆发了一起遍布英格兰威尔士由CAl6引起的手足口病流行，监测哨点共观察到952个病例，为该国有记录以来的最大一次。患者大多1-4岁。2000年新加坡发生HFMD暴发，发病3790例，死亡5例。2000年9月至10月，新加坡报告手足口病3790例，5例死亡，CA16是主要的病原体。我国1981年上海报告了手足口病，病原体为肠道病毒71型(EV71)。此后，在北京、河北、天津、福建、山东等地均有报道。1983年厦门发生HFMD流行，从患儿标本分离出CA16型病毒。同年天津发生了由CA16引发的手足口病。1998年我国台湾地区发生EV71感染的手足口病流行，病例达13万人。2000年5～8月山东招远发病近1700例。2008年后，手足口病呈蔓延趋势。2008年3月至5月，安徽阜阳累计报告病例3736例，其中22例死亡。在我国大部分省区都有此病报导。其实多种肠道病毒可引起手足口病，但是其中肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)为我国近几年手足空病的主要病原体。CA16是HFDM早期流行的主要病原体，但因其发病症状相对较轻，未引起广泛关注，目前尚未有预防CA16的疫苗。柯萨奇病毒感染人后可以导致多种疾病，包括呼吸道疾病、心肌炎、心包炎及神经系统等疾病。而且手足口病的主要传播人群为隐形感染者，由于肠道病毒感染后大多数人表现为隐形感染，临床不易被发现，故难以开展有效的隔离措施，容易造成传播，因此，开发疫苗对于预防手足口病具有重要意义。目前，国际上对手足口病疫苗的研究主要有灭活疫苗、病毒样颗粒(VirusLikeParticle，VLP)疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒活疫苗等。目前，用于预防手足口病的疫苗只有国内上市销售，属于灭活疫苗，预防由EV71引起的手足口病；对于CA16疫苗，现在还是处于临床前研究，主要为灭活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗和减毒活疫苗。研究进展较快的为灭活疫苗，但是灭活疫苗具有毒逆、灭活时病毒颗粒被破坏及空心实心颗粒差异导致批间不稳定。因此，研制更加安全、有效的针对CA16的预防性疫苗对控制婴幼儿手足口病的流行具有十分重大的意义。病毒样颗粒疫苗的出现为研发新型安全有效的疫苗提供了一个新的契机。病毒样颗粒是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸(DNA/RNA)，不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力。VLPs疫苗没有感染性，稳定性好，不易失活，具有广阔的发展前景。CA16病毒颗粒为二十面球形结构，立体对称，直径约为23～30nm，无包膜，无突起，病毒有单股正链RNA和蛋白组成。RNA链全长约为7400个核苷酸左右；其蛋白外壳由4个多肽链组成，即为VP1、VP2、VP3和VP4。这4个蛋白组成一个亚单位，再由60个亚单位构成病毒的衣壳蛋白。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力。VLPs疫苗没有感染性，稳定性好，不易失活，具有广阔的发展前景。目前常用于病毒样颗粒的表达体系主要有原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统表达的蛋白大多失去天然构象，不能产生保护性抗体。或者表达产物多为包涵体，包涵体变性、复性步骤复杂，尤其VLP的表达，纯化工艺更为复杂。真核表达系统有哺乳动物细胞表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中蛋白能自发的形成VLP，为纯化工艺提供极大的便利。但是，采用昆虫细胞制备VLP，培养条件要求较高，纯化过程复杂，限制了大规模的生产需求；另外，杆状病毒-昆虫细胞表达系统产生杆状病毒颗粒及其它影响疫苗效果的污染物，杆状病毒颗粒很难与制备的VLP分离，且需要进行灭活处理等措施，因此对疫苗质量有很大的影响。多形汉逊酵母表达系统具遗传性质稳定、操作简单、高密度发酵培养、目的产物产量高、生产成本低、适合于工业化大生产等特点，还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白翻译后加工等优势，是一种优于大肠杆菌和其它真核表达系统的较为先进的VLP疫苗表达系统。
技术实现思路
本专利技术的目的一是提供一种从汉逊酵母表达系统中表达的CA16类病毒颗粒的纯化方法，更利于线性放大，并可以大规模制备和纯化，并可得到高纯度(大于99％)的VLP原液，可用于制备预防CA16感染的疫苗，具有较好的经济价值和应用前景。本专利技术的上述专利技术目的一是通过以下技术方案得以实现的：重组CA16病毒样颗粒的纯化方法，包括以下步骤：(1)将含CA16外壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因的重组汉逊酵母工程菌发酵；(2)破碎工程菌，目的产物澄清、超滤；(3)离子交换层析；(4)羟基磷灰石层析；(5)分子筛层析。通过采用上述技术方案，经试验发现，采用上述方法可获得高纯度(大于99％)的VLP原液，用于人用疫苗制备。本专利技术采用三步层析，工艺简单，抗原回收率高达40％以上，生产工艺可控性强，可规模化生产，具有很高的社会价值和经济价值。优选的：步骤(2)破碎工程菌的方法为将工程菌采用细胞裂解缓冲液重悬，在压力1100～1400bar的条件下破碎细胞2-4次；所述细胞裂解缓冲液为20mMNaH2PO4，2mMEDTA-Na2，0.2～1.0MNaCl，2mMPMSF，0.01％～1.0％吐温-80，pH6.8～7.4。优选的，将工程菌在压力1250bar的条件下破碎细胞2次。通过采用上述技术方案，经大量实验发现，本申请中细胞经过1250Bar破碎一次，破碎率可达50～70％；破碎两次，破碎率可达85％～95％，破碎三次后破碎率可达90％～95％以上，考虑到破碎时间成本和破碎后蛋白稳定性效果，破碎两次破碎率大于85％优选。优选的：步骤(2)目的产物澄清液收获方法为：将破碎后的细胞液倒入离心筒中，进行6000～8000rpm离心40～60min，收集澄清液；或者采用将破碎后的细胞液通过深层滤器过滤，过滤流速为925～1850mL/min/m2，收集澄清夜；优选的：将破碎后的细胞液倒入离心筒中，进行7000rpm离心40min，收集澄清液。通过采用上述技术方案，经大量实验发现，本申请中细胞破碎液采用离心转速低于6000rpm，破碎后菌体碎片无法去除，采用高于8000rpm需要更换离心机转子500mL离心杯而降低处理量，因此采用1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组CA16病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将含CA16外壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因的重组汉逊酵母工程菌发酵；（2）破碎工程菌，目的产物澄清、超滤；（3）离子交换层析；（4）羟基磷灰石层析；（5）分子筛层析。

【技术特征摘要】
1.重组CA16病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将含CA16外壳蛋白P1基因和3CD蛋白酶基因的重组汉逊酵母工程菌发酵；（2）破碎工程菌，目的产物澄清、超滤；（3）离子交换层析；（4）羟基磷灰石层析；（5）分子筛层析。2.根据权利要求1所述的重组CA16病毒样颗粒的纯化方法，其特征是，步骤（2）破碎工程菌的方法为将工程菌采用细胞裂解缓冲液重悬，在压力1100~1400bar的条件下破碎细胞2-4次；所述细胞裂解缓冲液为20mMNaH2PO4，2mMEDTA-Na2，0.2~1.0MNaCl，2mMPMSF，0.01%~1.0%吐温-80，pH6.8~7.4；优选的将工程菌在压力1250bar的条件下破碎细胞2次。3.根据权利要求1所述的重组CA16病毒样颗粒的纯化方法，其特征是，步骤（2）目的产物澄清液收获方法为：将破碎后的细胞液倒入离心筒中，进行6000~8000rpm离心40~60min，收集澄清液；或者采用将破碎后的细胞液通过深层滤器过滤，过滤流速为925~1850ml/min/m2，收集澄清夜；优选地，将破碎后的细胞液倒入离心筒中，进行7000rpm离心40min，收集澄清液。4.根据权利要求1所述的重组CA16病毒样颗粒的纯化方法，其特征是，步骤（2）的超滤为：收集的上清液以100~500KD的膜包采用pH7.5~8.5的缓冲液进行超滤以除掉小分子物质，收集超滤液，得到粗纯蛋白液，其中缓冲液的组分及摩尔配比如下：三羟甲基氨基甲烷2-5份NaCl15-30份缓冲液中还包含质量分数为0~10%的甘油水溶液；优选地，缓冲液pH为8.0，三羟甲基氨基甲烷和NaCl的摩尔比为1:5，缓冲液中还包含质量分数为5%的甘油水溶液。5.根据权利要求1所述的重组CA16病毒样颗粒的纯化方法，其特征是，步骤（3）的离子交换层析为：采用20~50mM三羟甲基氨基甲烷、0.15~0.30MNaCl和重量百分比为0~10%的甘油水溶液形成pH7.5~8.5的缓冲液平衡5~10个柱体积后上样，收集穿透液UV280nm紫外吸收峰，即为一步层析蛋白液；优选地，采用50mM三羟甲基氨基甲烷、0.25MNaCl和重量百分比...

【专利技术属性】
技术研发人员：李国顺，顾美荣，张改梅，刘司航，刘俊杰，马廷涛，郭林，简伟，肖海峰，刘建凯，朱征宇，甘建辉，郑海发，
申请(专利权)人：深圳鑫泰康生物科技有限公司，北京民海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44