一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种人脐带华通胶间充质干细胞(Wharton’s jelly‑derived mesenchymal stem cells,WJMSCs)的制备方法。本发明专利技术所述WJMSCs来自于足月产健康新生儿脐带。本发明专利技术所述脐带华通胶间充质干细胞，增殖分化能力强，生物性能稳定，其不表达MHC‑II，MHC‑I的表达远低于骨髓间充质干细胞，且来源广泛，取材方便，供者无痛苦，易于收集、提取和保存，且相对纯净，污染少，具有广阔的临床应用前景。

Preparation of human umbilical cord Huatong gum mesenchymal stem cells

The invention discloses a preparation method of human umbilical cord Huatong gum mesenchymal stem cells (WJMSCs). The WJMSCs of the invention are derived from the umbilical cord of healthy full-term newborns. The umbilical cord Huatong gum mesenchymal stem cells of the invention have strong proliferation and differentiation ability, stable biological performance, no expression of MHC II, MHC I is much lower than that of bone marrow mesenchymal stem cells, and have wide sources, convenient materials, painless donors, easy collection, extraction and preservation, relatively pure, less pollution, and broad clinical application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法
本专利技术属于医药领域，具体涉及一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法。
技术介绍
间充质干细胞是来源于中胚层的干细胞，是一种非造血来源的多向分化潜能的干细胞。由于其免疫源性弱，并能向多种组织增殖分化，因此，已经成为组织工程
及细胞移植治疗中理想的种子细胞来源。最早，在人骨髓中发现间充质干细胞，然而，骨髓中还存在大量其他细胞，如造血细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等，间充质干细胞含量相对较少，分离纯化相对困难，同时发现，随着年龄的增长，骨髓间充质干细胞的数量和增殖分化能力均显著下降。同时，获取骨髓组织对供者带来较大困苦和创伤，难以广泛应用于临床。相比于骨髓间充质干细胞，华通胶间充质干细胞，来源于新生儿脐带，属于医疗废弃组织，对供者不产生困苦和损伤，且来源广泛，因此更容易得到推广应用于临床。华通胶组织是脐带动静脉之间的胶冻样间质，含有较多胶原纤维，胶原酶能够水解华通胶组织的胶原纤维结构，但不会对WJMSCs造成损伤。
技术实现思路
为了较少对供者的创伤，获取生物纯度及活性更高的间充质干细胞，本专利技术提供一种WJMSCs的制备方法。其技术方案如下：本专利技术任一项所述WJMSCs的制备方法，包括以下步骤：1、试剂配制(1)0.2％II型胶原酶100mgII型胶原酶加入50mlDMEM/F12培养基，完全溶解后，0.22μm过滤除菌。(2)DMED/F12完全培养基450mlDMEM/F12培养基内加入50ml特级胎牛血清，配置成含10％胎牛血清的完全培养基，加入青霉素及链霉素，使浓度为100u/mL青霉素、100μg/mL链霉素。2、WJMSCs分离培养步骤(1)取足月产健康新生儿脐带约30cm，无菌储存于D-Hanks液中，2-6℃保存；(2)在超净台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，用手术剪将脐带剪成4cm大小节段，取每一节段，手术剪纵行剪开脐带外膜，仔细游离2条脐带动脉和1条脐带静脉并丢弃，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃恒温消化18小时；(3)观察消化情况，未见组织块，消化液成粘稠状，2500rpm离心10min，弃掉上层上清，剩余粘稠状液体再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟；(4)消化后2500rpm离心10min，弃上清，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20％，于37℃，5％CO2条件培养；(5)细胞于第2天开始贴壁生长，第4天用含20％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基进行换液；(6)以后每2到3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养；(7)弃上清，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心，进行细胞传代；(8)传代后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。同现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)取材方便，来源广泛，对供者无创伤，分离培养方法简单，不受伦理、道德及法律限制。(2)本专利技术获得的WJMSCs相对纯净，无杂质细胞，污染机会少。(3)脐带中MSCs含量丰富，高于其他组织，且不受年龄影响，增殖分化能力强，生物性能稳定。(4)人WJMSCs不表达MHC-II，MHC-I的表达远低于骨髓间充质干细胞，属于免疫缺陷细胞，因此在异体移植中无免疫排斥反应或者反应较弱，临床应用前景广阔。具体实施例实施例1分离培养华通胶间充质干细胞26岁女性，初产妇，胎儿足月产，剖宫产，取新鲜新生儿脐带约30cm为材料，无菌储存于D-Hanks液中，2-6℃保存。所取脐带材料以足月产健康新生儿脐带为优，可保证其脐带发育良好；再则，优选剖腹产新生儿脐带，较之阴道产感染率低。在超净工作台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成4cm大小节段，对每一节段均纵行剪开脐带外膜，游离去除2条脐动脉和1条脐静脉，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，胶原酶溶液，置37℃消化5小时，观察消化情况，未见组织块，消化液成粘稠状，2500rpm离心10分钟，弃掉上层上清液，剩余粘稠液体再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟，2500rpm离心10分钟，弃上清液，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20％，于37℃、5％二氧化碳条件培养。细胞于第2天开始贴壁，第4天用含20％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基进行换液。以后每2～3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。弃上清液，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5分钟，1000rpm离心，进行细胞传代。传代后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。实施例2分离培养华通胶间充质干细胞28岁女性，经产妇，胎儿足月产，剖宫产，取新鲜新生儿脐带约20cm为材料，无菌储存于D-Hanks液中，2-6℃保存。在超净工作台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成5cm大小节段，对每一节段均纵行剪开脐带外膜，游离去除脐动脉、脐静脉，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃消化5小时，待消化液成粘稠状，2500rpm离心10分钟，弃掉上清液，再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟，2500rpm离心10分钟，弃上清液，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度为20％，37℃、5％二氧化碳条件培养。细胞于第3天开始贴壁，第5天用含20％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基进行换液。以后每2～3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。弃上清液，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5分钟，1000rpm离心，进行细胞传代。传代后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。实施例3分离培养华通胶间充质干细胞25岁女性，经产妇，胎儿足月产，剖宫产，取新鲜新生儿脐带约30cm为材料，在超净工作台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成6cm大小节段，均纵行剪开脐带外膜，游离去除脐动脉、脐静脉，取华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃消化5小时，待消化液成粘稠状，2500rpm离心10分钟，弃掉上清液，再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化30分钟，2500rpm离心10分钟，弃上清液，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度为20％，37℃、5％二氧化碳条件培养。细胞于第2天开始贴壁，第4天用含20％胎牛血清的DMEM/F12完全培养基进行换液。以后每3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。弃上清液，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5分钟，1000rpm离心，进行细胞传代。传代后用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。以上所述仅为本专利技术的实施例，并非因此限制本专利技术的专利范围，凡是利用本专利技术说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
，均同理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，采用以下方法制备：取新生儿脐带，用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于0.2％Ⅱ型胶原酶溶液中消化；消化离心弃上清两次后，加DMEM/F12培养基和胎牛血清培养；细胞于贴壁生长后，用DMEM/F12完全培养基进行换液，待细胞融合达到80‑90％时，进行传代培养。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，采用以下方法制备：取新生儿脐带，用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于0.2％Ⅱ型胶原酶溶液中消化；消化离心弃上清两次后，加DMEM/F12培养基和胎牛血清培养；细胞于贴壁生长后，用DMEM/F12完全培养基进行换液，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养。2.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，其使用的新生儿脐带，是足月产新生儿，且产妇的乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体、艾滋病抗体免疫4项均为阴性的健康产妇。3.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，将脐带在超净台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，用手术剪将脐带剪成4cm大小节段，进入下一工序。4.根据权利要求1所述的人脐带华通胶间充质干细胞的制备方法，其特征在于，取每一节段，手术剪纵行剪开脐带外膜，仔细游离2条脐带动脉和1条脐带静脉并丢弃，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置37℃恒温消化18小时，进入下一工序。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱迪·德瓦库玛，焦阳，王铁，杨丽华，李靖，
申请(专利权)人：江苏瑞思坦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32