干细胞的层分离培养及增殖方法技术

本发明专利技术涉及干细胞的层分离培养及通过其获取的单克隆干细胞的增殖方法。根据本发明专利技术的干细胞的层分离培养及增殖方法，除了可快速无污染地获取单克隆干细胞的层分离培养法的优点之外，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此可有效利用于干细胞治疗剂的制备。

Stratified Isolation, Culture and Proliferation of Stem Cells

The present invention relates to the layer separation culture of stem cells and the proliferation method of monoclonal stem cells obtained by the layer separation culture. According to the present invention, in addition to the advantages of the layer separation culture method for obtaining monoclonal stem cells quickly and without pollution, the required monoclonal stem cells can be obtained in large quantities in a short time through the rapid proliferation of monoclonal stem cells, which can be effectively used in the preparation of stem cell therapeutics.

【技术实现步骤摘要】
干细胞的层分离培养及增殖方法
本专利技术涉及干细胞的层分离培养及通过其获取的单克隆干细胞的增殖方法。
技术介绍
干细胞具有可成长为我们身体的210多个所有器官的组织的潜在能力，并且可无限分裂，并通过适当的操作而分化成所需的器官。由于这种干细胞的特性，干细胞作为新型治疗剂而备受瞩目，并且利用干细胞治疗难治性疾病的可能性非常高，预计可治疗许多疾病，如白血病，骨质疏松症，肝炎，帕金森病，老年性痴呆，烧伤等。然而，在干细胞的情况下，在很难大量获取其的这一点上仍然具有很多限制。作为获取干细胞的方法，可以说从冷冻胚胎细胞获取的方法为有效，但在伦理方面还存在许多争议。为了解决这种问题，还研究了利用体细胞核移植方法或成体干细胞来获取干细胞的方法。比胚胎干细胞的研究更加活跃进行的领域为成体干细胞的研究。作为存在于中枢神经系统或骨髓等各种器官中而参与成长期的器官发育及损伤时的再生的细胞，成体干细胞存在于各种器官中，因此可在包括骨髓、脾脏、脂肪细胞等的各种部位获取，但从骨髓获取的方法为最常见的。但是，在从许多各种骨髓细胞中分离并培养多个间充质干细胞的方面上，难以获取始终呈均匀形态的细胞，因此正在进行用于完善这种问题的研究。作为在分离初期利用所谓菲科帕克(Ficoll-paque)的方法来仅将多个单核细胞分离并将细胞附着于培养容器中的方法的Friedenstein等人所使用的分离方法仍然被广泛使用，但在使用这种方法的情况下，细胞的特性不恒定，间充质干细胞可与其他多个单核细胞共同存在，因此很难产生单一性细胞组。因此，已经设计出了用于取得更为相同的细胞的各种方法，但用于分离附着于培养容器的底部成长的所有细胞的Luria等人的方法存在可混合分离出不是间充质干细胞的其他干细胞的缺点(Luriaetal.，Transfusion，11:345-349，1971)，Simmons等人的方法为利用在间充质干细胞的细胞表面抗原中的使用对Sca-1、STRO-1的特异性抗体的方法，因此成本较多且一直存在污染问题(Simmonsetal.，Blood，78:55-62，2002)。作为利用细胞大小之差的间充质干细胞分离方法，Hung等人的方法存在间充质干细胞的纯度不恒定并有可能混入其他干细胞的缺点(Hungetal.，StemCells，20:249-258，2002)。为了解决如上所述的问题，本专利技术人专利技术了新式的命名为层分离培养法(subfractionationculturingmethod，SCM)的干细胞的分离方法，通过韩国专利申请KR10-2006-0075676号申请了专利，并取得了授权。与其他方法相比，上述层分离培养法不仅能够以低成本进行，并且不存在污染问题，可不用顾虑混入其他干细胞而有效地获取单克隆间充质干细胞(MSC)的这一点上，与其他的干细胞获取方法相比，具有极好的优秀性。由本专利技术人设计的新型层分离培养法(subfractionationculturingmethod，SCM)可从小鼠及人类细胞获取源自单细胞的单克隆间充质干细胞，并不需要离心分离或酶降解。上述层分离培养法的原理为基于细胞密度及孵育板附着来分离间充质干细胞。但是，尽管上述方法具有优秀性，但为了大量生产单克隆间充质干细胞来用作最终产物，层分离培养法需要制造工作细胞库，并通过它来获取最终产物的工序才可取得充分量的单克隆间充质干细胞，并且需要约10次传代至12次传代的培养，因此从这一方面上，难以快速取得单克隆间充质干细胞集团。
技术实现思路
在通过如上所述的层分离培养法的改善来研究用于诱导单克隆干细胞的快速增殖的研究当中，本专利技术人发现将单克隆干细胞的培养细胞密度调低，并添加抗氧化剂来进行培养的情况下，可诱导出有效的细胞增殖率的增加，并且完成了本专利技术。因此，本专利技术的目的在于，提供得以改善的现有的层分离培养法的干细胞的层分离培养及增殖方法。为了实现上述目的，本专利技术提供包括如下步骤的干细胞的层分离培养及增殖方法：步骤1)，培养的骨髓；步骤2)，仅将上述步骤1)的上清液移入新的容器来进行培养；步骤3)，仅分离出上述步骤2)的上清液，在培养容器中在37℃温度条件下培养1小时至3小时，然后在37℃下将上清液的培养重复2次至3次(每次12小时至36小时)，接着，在37℃温度条件下将上清液培养24小时至72小时，每次均将上清液移入新的培养容器来重复培养；步骤4)，在最终培养容器中获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将单克隆干细胞接种于培养基中并进行培养。根据本专利技术的干细胞的层分离培养及增殖方法，除了可快速无污染地获取单克隆干细胞的层分离培养法的优点之外，可通过单克隆干细胞的快速增殖，在短时间内大量获取所需的单克隆干细胞，由此可有效利用于干细胞治疗剂的制备。附图说明图1为示出从人的骨髓的分离间充质干细胞的层分离培养法的图。图2为示出通过显微镜观察并确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的形态学变化的结果的图。图3的A部分为示出通过流式细胞荧光分选技术(FACS)分析来将根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的细胞大小及粒度(granularity)的变化以前向散射(FSC)的平均值来进行确认的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。图3的B部分为示出通过流式细胞荧光分选技术(FACS)分析来将根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的细胞大小及粒度(granularity)的变化以SSC的平均值来进行确认的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。图4为示出通过β-gal-染色法来对细胞培养密度及细胞培养传代不同的间充质干细胞进行染色之后确认细胞是否老化的结果的图。图5为示出以不同的细胞培养密度来培养传代15次的间充质干细胞之后利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)来确认作为老化相关基因的P15、P16及作为增殖标记的增殖细胞核抗原(PCNA)的结果的图。图6为示出通过群体倍增时间(PDT，Populationdoublingtime)及群体倍增水平(PDL，Populationdoublinglevel)来确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的增殖能力的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。图7示出确认根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞的分化能力的结果的图(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005)。图7的A部分为通过油红O组织学染色法来确认分化为根据细胞培养及细胞培养传代的间充质干细胞的脂肪细胞的分化能力的图。图7的B部分为示出对A部分的组织学染色程度进行定量化的图。图7的C部分为通过茜素红S(AlizarinredS)组织学染色来确认分化为根据细胞培养及细胞培养传代的间充质干细胞的骨化细胞的分化能力的结果。图7的D部分为示出对C部分的组织学染色程度进行定量化的图。图8的A部分为示出由根据细胞培养密度及细胞培养传代的间充质干细胞生产的总活性氧(ROS)生产的图。图8的B部分为示出通过彗星试验(cometassay)来确认由根据细胞培养密度及细胞培养传代的总活性氧生产引起的脱氧核糖核酸(DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种干细胞的层分离培养及增殖方法，所述方法包括：步骤1)，培养骨髓；步骤2)，仅将上述步骤1)的上清液移入新的器皿并进行培养；步骤3)，仅分离出上述步骤2)的上清液，在37℃下将上清液在培养容器中培养1小时至3小时；然后，在37℃下将上清液的培养重复2次至3次，每次12小时至36小时；接着，在37℃下将上清液培养24小时至72小时，其中，每次均将上清液移入新的培养容器来重复培养；步骤4)，在最终培养容器中获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm

【技术特征摘要】
2017.11.06 KR 10-2017-01469061.一种干细胞的层分离培养及增殖方法，所述方法包括：步骤1)，培养骨髓；步骤2)，仅将上述步骤1)的上清液移入新的器皿并进行培养；步骤3)，仅分离出上述步骤2)的上清液，在37℃下将上清液在培养容器中培养1小时至3小时；然后，在37℃下将上清液的培养重复2次至3次，每次12小时至36小时；接着，在37℃下将上清液培养24小时至72小时，其中，每次均将上清液移入新的培养容器来重复培养；步骤4)，在最终培养容器中获取单克隆干细胞；以及步骤5)，以50细胞/cm2至1000细胞/cm2的细胞密度将所述单克隆干细胞接种于培养基中并对所述细胞进行培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述步骤5)的培养为传代1次至传代5次的培养。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，上述步骤5)的培养通过以1000细胞/cm2的细胞密度将所述单克隆干细胞接种于培养基中来进行。4.根据权利要求1或2...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋淳旭，金时那，赵润京，咸栋植，
申请(专利权)人：SCM生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国,KR