人源脂肪干细胞外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种脂肪干细胞来源的外泌体以及制备所述外泌体的方法。本发明专利技术的脂肪干细胞来源的外泌体能够用于治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病。本发明专利技术的脂肪干细胞来源的外泌体能够显著升高急性肝衰竭患者的存活率，在高浓度下，甚至能够使得急性肝衰竭患者的存活率达到100％。

Human Adipose Stem Cell Exosome and Its Preparation and Application

The invention provides an exosome derived from adipose stem cells and a method for preparing the exosome. The exosome derived from adipose stem cells of the invention can be used for treating acute liver failure, liver fibrosis, liver cirrhosis and other liver diseases. The exosome derived from adipose stem cells of the invention can significantly increase the survival rate of patients with acute liver failure, and even can make the survival rate of patients with acute liver failure reach 100% at high concentration.

【技术实现步骤摘要】
人源脂肪干细胞外泌体及其制备方法和应用
本专利技术涉及干细胞及生物医药领域。具体地说，本专利技术涉及人源脂肪干细胞(Human-AdiposeDerivedStemCell，hADSC)外泌体及其制备方法和在治疗急性肝衰竭等疾病中的应用。
技术介绍
肝功能衰竭(Liverfailure)严重威胁人类健康。原位肝移植是目前最有效的治疗手段，但治疗费用高且受肝源限制，难以作为终末期肝病患者的常用治疗方法[1-3]。随着干细胞(Stemcell)技术的成熟，已证实干细胞可通过“细胞替代”或“旁分泌作用”促进受损器官组织细胞再生[4-7]。脂肪干细胞(Humanadipose-derivedstemcells，hASC)作为成体干细胞的一种，具有更高的增殖速率和更强的分化能力，且其取材相对容易，有望用于急性肝衰竭(Acuteliverfailure，ALF)等重症肝病的治疗[8-10]。起初研究者认为干细胞主要通过“细胞替代作用”修复组织损伤[11-13]，然而，近期的几项动物试验证实，外源性干细胞移植到体内后通常会在短期被受体免疫系统清除，分化成为目的细胞的数量非常少，说明干细胞真正的作用机制很可能在于其旁分泌能力[14-16]。本专利技术人在急性肝衰竭大鼠模型中也发现hASC有助于大鼠生存率的提高和肝功能的恢复，但hASC移植后短期内并不表达肝细胞相关蛋白，推测hASC的主要作用机制为“旁分泌作用”而非“细胞替代作用”[4]。hASC可以通过外泌体(Exosome)的形式向胞外分泌大量蛋白和RNA，外泌体的双层膜性结构可保护其内的蛋白和RNA更不易被细胞外的各种酶所降解，还可通过与目的细胞表面受体的相互作用发挥功能[17-20]。目前已有研究小组，从干细胞条件培养基中分离其外泌体，用于心脏、肾脏疾病动物模型中，发现干细胞外泌体移植比干细胞移植疗效更佳，表现出更出色的促进组织修复和促进再生的作用[21-28]。然而，不同干细胞来源的外泌体或者同一干细胞来源的不同外泌体适用于何种组织的修复和再生未知，其是否均具有的促进组织修复和再生的作用以及促进组织修复和再生的作用是否显著也是未知的。因此，本领域急需能够用于急性肝衰竭等疾病治疗的干细胞来源的外泌体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种脂肪干细胞来源的外泌体，所述的外泌体能够用于治疗急性肝衰竭等疾病。本专利技术还提供了这种脂肪干细胞来源的外泌体的制备方法及其用途。在第一方面，本专利技术提供一种脂肪干细胞来源的外泌体，所述外泌体包含蛋白和lncRNAH19，并且所述外泌体具有以下一种或多种特征：1)所述外泌体的直径为约30-200nm；2)所述外泌体的平均尺寸约为100nm；3)所述外泌体的强度约为0.5-6a.u.；4)所述外泌体的表面具有以下一种或多种特征分子：CD81、ANXA5、ICAM、ALIX、TSG101、FLOT1、CM130、CD63、CD9。在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞是人源脂肪干细胞。在具体的实施方式中，所述外泌体通过以下方法获得：1)培养获得的脂肪干细胞；2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。在优选的实施方式中，获得所述脂肪干细胞来源的外泌体包括：培养获得的脂肪干细胞以获得培养液，并以3000×g离心15分钟以除去细胞和细胞碎片。将上清液转移到无菌容器中，并将适量的ExoQuick-TC(SystemBiosciences，美国)加入生物液体中。通过颠倒或轻弹试管作良好混合。在4℃冷藏过夜。以1500×g离心30分钟。以1500×g离心5分钟将残留的ExoQuick-TC溶液旋下。通过抽吸去除所有痕量的液体。将外泌体沉淀重悬于500μl无菌1XPBS中。在具体的实施方式中，所述方法还包括鉴定获得的外泌体的上述一种或多种特征。在第二方面，本专利技术提供本专利技术第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体的制备方法，所述方法包括以下步骤：1)培养获得的脂肪干细胞；2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。在优选的实施方式中，获得所述脂肪干细胞来源的外泌体包括：培养获得的脂肪干细胞以获得培养液，并以3000×g离心15分钟以除去细胞和细胞碎片。将上清液转移到无菌容器中，并将适量的ExoQuick-TC(SystemBiosciences，美国)加入生物液体中。通过颠倒或轻弹试管作良好混合。在4℃冷藏过夜。以1500×g离心30分钟。以1500×g离心5分钟将残留的ExoQuick-TC溶液旋下。通过抽吸去除所有痕量的液体。将外泌体沉淀重悬于500μl无菌1XPBS中。在具体的实施方式中，所述方法还包括鉴定获得的外泌体的上述一种或多种特征的步骤。在优选的实施方式中，所述脂肪干细胞来源的外泌体用于治疗急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病；优选急性肝衰竭。在第三方面，本专利技术提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本专利技术第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体以及任选的药学上可接受的载体。在具体的实施方式中，所述药物组合物是将本专利技术第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体溶解于右旋糖苷溶液得到的液体制剂。在优选的实施方式中，所述药物组合物中包含高浓度的脂肪干细胞来源的外泌体；例如，所述药物组合物中脂肪干细胞来源的外泌体的浓度量使得给予受试者时，给药量达到100-1000μg/kg受试者体重；优选140-800μg/kg受试者体重；最优选500-750μg/kg受试者体重。在第四方面，本专利技术提供一种试剂盒，所述试剂盒装有：1)本专利技术第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体，或第三方面所述的药物组合物；和2)任选的使用说明书。在具体的实施方式中，所述使用说明书注明将所述的脂肪干细胞来源的外泌体或所述药物组合物给予受试者时，给药量为100-1000μg/kg受试者体重；优选140-800μg/kg受试者体重；最优选500-750μg/kg受试者体重。在第五方面，本专利技术提供第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体在制备治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病包括但不限于急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化等肝病；所述疾病优选急性肝衰竭。在第六方面，本专利技术提供一种疾病的治疗方法，所述方法包括利用第一方面所述的脂肪干细胞来源的外泌体，或第三方面所述的药物组合物，或第四方面所述的试剂盒来治疗有此需要的对象的步骤，其中所述疾病包括但不限于急性肝衰竭、肝纤维化、肝硬化；优选急性肝衰竭。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示hASC的分离与鉴定；其中，A：显微镜下观察到hASC的形态呈长梭形，排列紧密；P5代细胞形态、大小、密度和P0相比均无显著变化；B：流式细胞仪检测hASC的免疫表型，可见CD90、CD44、CD105、CD73等表面标记呈阳性表达；C：hASC成脂分化后油红O染色后可见红色脂滴(400×)，h本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脂肪干细胞来源的外泌体，所述外泌体包含蛋白和lncRNA H19，并且所述外泌体具有以下一种或多种特征：1)所述外泌体的直径为约30‑200nm；2)所述外泌体的平均尺寸约为100nm；3)所述外泌体的强度约为0.5‑6a.u.；4)所述外泌体的表面具有以下一种或多种特征分子：CD81、ANXA5、ICAM、ALIX、TSG101、FLOT1、CM130、CD63、CD9。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪干细胞来源的外泌体，所述外泌体包含蛋白和lncRNAH19，并且所述外泌体具有以下一种或多种特征：1)所述外泌体的直径为约30-200nm；2)所述外泌体的平均尺寸约为100nm；3)所述外泌体的强度约为0.5-6a.u.；4)所述外泌体的表面具有以下一种或多种特征分子：CD81、ANXA5、ICAM、ALIX、TSG101、FLOT1、CM130、CD63、CD9。2.如权利要求1所述的脂肪干细胞来源的外泌体，其特征在于，所述外泌体通过以下方法获得：1)培养获得的脂肪干细胞；2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。3.如权利要求2所述的脂肪干细胞来源的外泌体，其特征在于，所述方法还包括鉴定获得的外泌体的权利要求1所述一种或多种特征。4.权利要求1-3中任一项所述的脂肪干细胞来源的外泌体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)培养获得的脂肪干细胞；2)收集步骤1)获得的培养液，离心除去细胞和细胞碎片；3)向步骤2)获得的上清液中加入缓冲液，然后冷藏过夜；4)将步骤3)得到的混合物离心，除去上清液，从而获得所述外泌体。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐俊，傅青春，金银鹏，高正良，李洪超，王晢，
申请(专利权)人：徐俊，
类型：发明
国别省市：上海,31