一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括：渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。本发明专利技术还公开了该冻存保护液的制备方法，具体为：1）将无血清基础培养基、非渗透性冷冻保护剂和血清替代品预冷，混合、摇匀；2）加入渗透性冷冻保护剂；3）在2~6℃温度条件下冷藏30min以上即可。本发明专利技术还公开了采用上述冻存保护液对人脐带华通氏胶组织的冻存方法，包括如下步骤：1）脐带预处理；2）剥取华通氏胶组织；3）人脐带华通氏胶组织冻存。本发明专利技术的冻存保护液和冻存方法处理人脐带华通氏胶组织，具有减少脐带间充质干细胞在冻存过程中的损伤，保证脐带间充质干细胞的活性和临床使用安全性的优点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，包括：渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。本专利技术还公开了该冻存保护液的制备方法，具体为：1）将无血清基础培养基、非渗透性冷冻保护剂和血清替代品预冷，混合、摇匀；2）加入渗透性冷冻保护剂；3）在2~6℃温度条件下冷藏30min以上即可。本专利技术还公开了采用上述冻存保护液对人脐带华通氏胶组织的冻存方法，包括如下步骤：1）脐带预处理；2）剥取华通氏胶组织；3）人脐带华通氏胶组织冻存。本专利技术的冻存保护液和冻存方法处理人脐带华通氏胶组织，具有减少脐带间充质干细胞在冻存过程中的损伤，保证脐带间充质干细胞的活性和临床使用安全性的优点。【专利说明】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其 制备与应用。 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用
技术介绍
脐带间充质干细胞是来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有自我更新、造血支 持、免疫调控和多向分化潜能，目前临床上可用于糖尿病终末期并发症，红斑狼疮，组织器 官损伤修复及造血干细胞辅助治疗等诸多方面。 目前，临床应用的干细胞种类繁多，与它们相比，脐带间充质干细胞具有免疫原性 低，移植不会出现免疫排斥等副作用，采集过程简单的优点，同时脐带间充质干细胞还具有 很强的增殖和分化能力，极少出现病毒和微生物感染，对产妇和新生儿无损害，因此，脐带 间充质干细胞是目前理想的干细胞来源。 华通氏胶是构成脐带的凝胶状物质，其含有黏多糖、成纤维细胞和巨噬细胞，是一 种粘膜组织，胶内部分细胞具有干细胞的特质，因此可以从脐带的华通氏胶中分离出脐带 间充质干细胞，是目前比较理想的干细胞来源。随之而来的对脐带华通氏胶组织进行冻存 成为了现今的研究热点，现有技术中主要采用传统的细胞冷冻方法对人脐带华通氏胶组织 进行冻存。如申请号为201210159916. 2名称为《脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干 细胞的方法》公开了脐带组织的冻存方法，主要步骤是对脐带组织进行消毒和清洗，将组 织剪成块状；然后将组织块和冻存液加入冻存管中，在4°C的温度条件下低温冷藏0. 5h， 再在-80°C的温度条件下冷冻1天，然后再液氮中冷冻备用即可，虽然其达到了冻存人脐 带组织的目的，但是这样的临床冻存方法需要花费较多的时间和成本，而还存在有如下缺 点：1、降温过程中，冷冻保护液在固液相变点处释放的热量无法及时抵消，导致脐带组织 温度反而上升，影响冷冻效果；2、无法准确知道冷冻过程中样品温度变化情况，不利于质量 控制；3、所用培养基中含有动物血清成分，异种血清的使用存在着很多不确定因素，比如， 血清批次之间的差别，异种蛋白的免疫原性，潜在的病原体等，可能对将来临床应用构成威 胁。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种对细胞损伤小，毒 副作用低，冻存效果好的人脐带冻存保护液，并提供一种易于制备，保存简单的人脐带冻存 保护液的制备方法。 本专利技术的另一目的是提供一种采用上述人脐带冻存保护液的应用，也就是采用上 述人脐带冻存保护液对人脐带华通氏胶组织进行冻存方法。 为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案： 一种人脐带华通氏胶组织的冻存保存液，包括如下体积百分比的组分： 渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品1(Γ20%和无血清基 础培养基7(Γ80%。 本方案中，渗透性冷冻保护剂是可以透过细胞膜渗透到细胞内的小分子物质，用 于人脐带华通氏胶的冻存时，在人脐带华通氏胶冷冻悬液完全凝固之前，可以渗透到细胞 内，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使人脐带华通氏胶组织不会被高浓度电解 质损伤，组织内水分不会过分外渗，避免组织过分脱水而伤害细胞。非渗透性冷冻保护剂一 般是些大分子物质，不能渗透到细胞内，通过优先同溶液中的水分子相结合，降低溶液中自 由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降 低，从而减轻溶质损伤。血清替代品为人工合成，组分明确，安全，批次间差异小，能够替代 血清提供细胞生长所需的营养、激素和生长因子，同时在冻存过程中对细胞提供一定程度 的保护。无血清基础培养基是指用人工方法配制而成的，未添加血清，含各种氨基酸和葡萄 糖等细胞生长基本营养物质的营养液。 本方案中，渗透性冷冻保护剂通过与非渗透性冷冻保护剂、血清替代品和无血清 基础培养基协同增效作用，在冻存过程中对细胞损伤小，毒副作用低，其冻存效果好。 作为优化，所述人脐带华通氏胶组织的冻存保护液包括如下体积百分比的组分： 渗透性冷冻保护剂10%、非渗透性冷冻保护剂5%、血清替代品10%和无血清基础培养基75%。 本方案中，采用渗透性冷冻保护剂10%、非渗透性冷冻保护剂5%、血清替代品10% 和无血清基础培养基75%制备人脐带华通氏胶组织的冻存保护剂，在保证冻存保护液性能 最好的同时，避免了异种血清的使用（例如常用的胎牛血清)，消除了将来临床使用障碍，同 时与其他的无血清配方冻存保护液相比(如201210159916. 2《脐带组织冻存、复苏以及分离 和扩增干细胞的方法》)，使用大量无血清基础培养基替代人血白蛋白，有效节约了成本。 作为优化，所述渗透性冷冻保护剂为二甲基亚枫或者甘油。 本方案中，采用二甲基亚枫或者甘油作为渗透性冷冻保护剂。二甲基亚枫和甘油 作为生物细胞冷冻保护剂，其具有价格低廉、来源广泛、冷冻效果好的优点。作为对本方案 的进一步优化，所述渗透性保护剂为二甲基亚砜，其分子量为2万，其具有较好的溶解性， 易于与其他组分互溶从而形成均一稳定的体系，同时具有良好的渗透性，极易渗透入组织 内部，从而达到保护组织的目的。 作为优化，所述非渗透性冷冻保护剂为羟乙基淀粉或者人血白蛋白。 本方案中，采用人血白蛋白作为非渗透性冷冻保护剂，主要因为：一方面，二甲基 亚砜可以引起轻微的蛋白质变性、破坏，融冻后出现小凝块；另一方面，人脐带华通氏胶组 织的冻存保护剂配制后会2~6°c预冷使用，毒性有所降低但不能避免；所以本方案以人血 白蛋白作为非渗透性保护剂，与其他组份配合使用，在冷冻过程中可以保护蛋白质，使其不 发生变形、破坏，同时降低冻存保护液中二甲基亚砜的毒性。 作为优化，所述血清替代品为FetalClone III或者Ultroser G。 作为优化，所述无血清基础培养基为DMEM/F12或者RPMI1640。 作为优化，所述人脐带华通氏胶组织的冻存保护液包括如下体积百分比的组分： 二甲基亚砜 10%，人血白蛋白 5%，FetalClone III 10% 和 DMEM/F12 75%。 本方案中，人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的组分为：二甲基亚砜10%，人血白 蛋白5%，FetalClone III 10%和DMEM/F12 75%，这样配制的冻存保护液在保证各组分完全 发挥功能，冻存效果佳的基础上，减少了蛋白和血清类制品的用量，大量使用了相对便宜的 DMEM/F12培养基，有效降低了成本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脐带华通氏胶组织的冻存保存液，其特征在于，包括如下体积百分比的组分：渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈林，董伟，张坤，
申请(专利权)人：重庆市红汇脐血干细胞中心有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85