本发明专利技术公开了一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株，其中一株是中国仓鼠卵巢细胞株CHO/3A2，其能产生抗体3A2，另一株是中国仓鼠卵巢细胞株CHO/5H7，其能产生抗体5H7，所述细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号依次为CCTCC NO.C2018188与NO.C2018226。实验证实利用本发明专利技术的两株细胞制备抗体量约为2g/L，较之前杂交瘤细胞的产量提高100倍，且抗体敏感性与之前的单克隆抗体一致，其组成抗体对与HCV‑cAg特异性结合，可进行ELISA检测。
【技术实现步骤摘要】
稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株及其应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株及其应用。
技术介绍
丙型病毒性肝炎，是一种由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要经输血、针刺、吸毒等传播，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)。未来20年内与HCV感染相关的死亡率将继续增加，因此应该采取一切有效措施来避免感染。目前，尚不存在可用于预防HCV感染的疫苗，提早发现是及时治疗、隔离丙型肝炎感染者的主要方法。丙型肝炎的诊断主要依赖于丙型肝炎抗原和核酸的检测。但是，由于病毒RNA在感染者血清样品中易降解、较不稳定，因此，HCVRNA的检测无法适用于大规模人群筛查。开发HCV相关抗原检测试剂盒对提早发现、治疗携带者和控制病毒传播具有重要价值，对保证人民健康和维护公共安全具有深远意义。HCVRNA大约有9500－10000bp组成，在5′非编码区下游紧接一开放的阅读框(ORF)，其中基因组排列顺序为5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3'，能编码一个长度大约为3014个氨基酸的多聚蛋白前体，后者可经宿主细胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成10种病毒蛋白，包括三种结构蛋白，即分子量19KD的核衣壳蛋白(或称核心蛋白，Core)和两种糖蛋白(分子量为33KD的E1蛋白，分子量72Kd的E2蛋白)，p7编码一种膜内在蛋白，其功能可能是一种离子通道。非结构蛋白部分则包括NS2，NS3，NS4A，NS5A和NS5B，非结构蛋白对丙肝病毒的生活周期非常重要。在HCV现症感染者中，RNA检测能够准确筛查出HCV感染者，而HCVcAg作为HCVRNA的相关性物质，因患者血清中HCV抗原含量极低，不易被检出。HCVcAg检测和HCVRNA检测的阳性符合率一般不高于60％，极易漏检。但是RNA作为分子检测手段，检测周期长、对检测人员的技术要求非常高、且费用较高，不适合所有医院的推广使用，基于此，寻找能够与HCVcAg具有高亲和力和特异性结合的抗体，有助于提高对于HCV感染者血清中HCVcAg检测的灵敏度和准确性，实现HCVcAg检测和HCVRNA检测的阳性符合率的提高和吻合，这对丙肝的临床检测应用具有重要意义。利用杂交瘤细胞制备单克隆抗体对的技术已经成熟，目前也有利用杂交瘤细胞制备有关HCVcAg具有高亲和力和特异性结合的单克隆抗体或利用其开发HCV抗原检测试剂或试剂盒的报道，但该方法制备的检测HCV-cAg的单克隆抗体量少，无法满足临床检验或相关检测试剂或试剂盒制备的需要。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是较为成熟的表达外源蛋白的哺乳动物细胞系，具有多年的实践运用经验。CHO细胞易于大规模培养，外源基因易于稳定整合入细胞的基因组，在表达外源蛋白中具有较大优势，利用它有望实现基因工程抗体的量产。但检索发现：目前，尚无以中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞，转染含有HCV-cAg单克隆抗体基因的表达质粒筛选获得能够稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株的报道，也没有将CHO工程细胞用于丙型肝炎病毒核心抗原抗体制备的应用报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株及其应用。本专利技术所述的一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株，该工程细胞株是以中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞，转染含有HCV-cAg单克隆抗体基因的表达质粒后经筛选获得；其特征在于：所述第一工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/3A2，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体3A2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018188；所述第二工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/5H7，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体5H7，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018226。用于构建上述工程细胞株的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述表达系统包括真核表达载体和HCV-cAg抗体基因或编码该HCV-cAg氨基酸序列或其抗原结合片段的核酸分子，其中所述真核表达载体选pBudCE4.1或pcDNA3.1，且该质粒带有Zeocin抗性作为筛选标签，该筛选标签能够通过转染DNA的方法导入细胞。其中，优选的实施方式是：上述表达系统先选择表达载体pBUDCE4.1-H1-L1(命名为pBudCE4.1-3A2)和表达载体pBUDCE4.1-H2-L2(命名为pBudCE4.1-5H7)；其中pBudCE4.1-3A2的核苷酸序列如SEQNO.9所示，pBudCE4.1-5H7的核苷酸序列如SEQNO.10所示。所述HCV-cAg抗体基因分别是编码命名为单克隆抗体2G7的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体丙型肝炎病毒核心抗原抗体3A2的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，其中所述单克隆抗体2G7产生于CCTCCNO.C2018229的杂交瘤细胞株；或是编码命名为单克隆抗体6A2的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体丙型肝炎病毒核心抗原抗体5H7的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其中所述单克隆抗体6A2产生于CCTCCNO.C2018230的杂交瘤细胞株；所述两株杂交瘤细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心。中国典型培养物保藏中心地址：中国，武汉，武汉大学。本专利技术所述的一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株在制备丙型肝炎病毒核心抗原抗体中的应用。其中：培养工程细胞时能够显著提高抗体产量的专用培养基配方是：CHO-S-SFMII干粉培养基10g/L，NaHCO32.40～2.45g/L，7～8mM谷氨酰胺，2±0.2mM柠檬酸铁，最终pH为7.0～7.2；该培养基命名为CHO-Med-01；培养工程细胞时采用的补料方式是：于第1、3、5、7、9或11天分别依次补加终浓度为7ml/L、8ml/L、9ml/L、10ml/L、9ml/L、8ml/L的FeedA。进一步的，培养工程细胞时能够显著提高抗体产量的专用培养基配方优选是：CHO-S-SFMII干粉培养基10g/L，NaHCO32.45g/L，8mM谷氨酰胺，2mM柠檬酸铁，最终pH为7.1。本专利技术所述的一对工程细胞株分泌产生的丙型肝炎病毒核心抗原抗体对，该基因工程抗体对包括独立存放的第一基因工程抗体和第二基因工程抗体；其特征在于：所述第一基因工程抗体命名为丙型肝炎病毒核心抗原抗体3A2，由中国仓鼠卵巢细胞株CHO/3A2细胞分泌产生，其轻链的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其重链的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述第二基因工程抗体命名为丙型肝炎病毒核心抗原抗体5H7，由中国仓鼠卵巢本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株，该工程细胞株是以中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞，转染含有HCV‑cAg单克隆抗体基因的表达质粒后经筛选获得；其特征在于：所述第一工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/3A2，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体3A2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018188；所述第二工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/5H7，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体5H7，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCC NO.C2018226。
【技术特征摘要】
1.一对稳定高效表达丙型肝炎病毒核心抗原抗体的工程细胞株，该工程细胞株是以中华仓鼠卵巢细胞(CHO)作为宿主细胞，转染含有HCV-cAg单克隆抗体基因的表达质粒后经筛选获得；其特征在于：所述第一工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/3A2，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体3A2，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018188；所述第二工程细胞株命名为中国仓鼠卵巢细胞株CHO/5H7，其能分泌产生丙型肝炎病毒核心抗原抗体5H7，该细胞株已于2018年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保存编号为：CCTCCNO.C2018226。2.用于构建权利要求1所述工程细胞株的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述表达系统包括真核表达载体和HCV-cAg抗体基因或编码该HCV-cAg氨基酸序列或其抗原结合片段的核酸分子，其中所述真核表达载体选pBudCE4.1或pcDNA3.1，且该质粒带有Zeocin抗性作为筛选标签，该筛选标签能够通过转染DNA的方法导入细胞。3.根据权利要求2所述的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述表达系统选择表达载体pBUDCE4.1-H1-L1，命名为pBudCE4.1-3A2和表达载体pBUDCE4.1-H2-L2，命名为pBudCE4.1-5H7；其中pBudCE4.1-3A2的核苷酸序列如SEQNO.9所示，pBudCE4.1-5H7的核苷酸序列如SEQNO.10所示。4.根据权利要求2所述的真核细胞外源基因表达系统，其特征在于：所述HCV-cAg抗体基因分别是编码命名为单克隆抗体2G7的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体丙型肝炎病毒核心抗原抗体3A2的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示，其中所述单克隆抗体2G7产生于CCTCCNO.C2018229的杂交瘤细胞株；或是编码命名为单克隆抗体6A2的核酸分子，同时也是编码基因工程抗体丙型肝炎病毒核心抗原抗体5H7的核酸分子，其轻链的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，其重链的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，其中所述单克...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱之炜，任素平，陈振，解光宁，欧兰香，王佳颖，王岩，张增丽，于晓杰，陈文丽，唐晓龙，
申请(专利权)人：山东莱博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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