一种检测常见水产类过敏原抗体的芯片及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种能够同时检测常见水产类过敏原抗体浓度的蛋白芯片，所述芯片通过如下步骤制得：（1）黑玻片预处理；（2）点样过敏原蛋白溶液；（3）对芯片进行封闭，制得所述芯片。本发明专利技术芯片用于检测病人的血液中过敏原抗体的浓度，由此判断病人对待测过敏原是否过敏以及程度高低。本方法形成的试剂盒使用方便，检出率高，而且还可以实现过敏原抗体检测的全自动化操作。

【技术实现步骤摘要】
一种检测常见水产类过敏原抗体的芯片及其制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种用于检测常见水产类过敏原抗体浓度的芯片及其制备方法。
技术介绍
随着全球经济水平的快速发展、人们的生活方式及居住环境条件的巨大变化，使得疾病谱也随之发生变化。2013年由世界卫生组织召开的世界卫生大会上已经明确提出：以过敏性疾病为代表的慢性非传染性疾病(NCD)，由于起病早、病情易波动反复、临床表型复杂多样等特点，已成为全球公共卫生关注的热点。过敏性疾病又称变态反应性疾病，是指机体对接触的某些致敏物质初次应答致敏后，再次接触相同致敏物质刺激时，所出现的一种以生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的异常免疫应答的疾病。过敏性疾病从新生儿到老年人的各个年龄阶段都可能发生，往往具有明显的遗传倾向。儿童过敏性疾病主要有过敏性休克、皮肤荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性肠炎等。而对于过敏性疾病的诊治，较对症治疗更重要的是检测出具体的致敏物质，并避免与之接触，以达到预防的目的。因此，检测过敏原抗体、分析其检测结果对儿童过敏性疾病的诊断、治疗及预防具有重要意义。水产品在人类饮食营养架构和健康生活中扮演着一个非常重要的角色，但其在易感个体中会引起严重的IgE抗体介导的不良反应。据流行病学调查，美国对水产品过敏的人数达690万，占总人口的2.3％。中国疾病预防控制中心的流行病学调查发现，我国成人的食物过敏发生率高达6％，主要过敏食物是水产品、牛奶和鸡蛋。水产类食物过敏引起的食品安全问题日益突出，其过敏发病率持续上升，据统计，在亚洲儿童食物过敏患者中，甲壳类占39％，鱼类占13.2％；成人中甲壳类占33.8％，软体类占18.9％。水产品过敏可导致患者出现皮肤红肿、哮喘、鼻炎等过敏性症状，严重时还伴随着虚脱、休克，甚至危及生命，严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量。人们常因为烹饪习惯把水产品中鱼类和甲壳类动物同时讨论，但其过敏原引起的致敏机制是不同的，所以得分开进行全面的讨论。鱼类过敏原：小清蛋白是鱼类的主要过敏原[2]，有95％的鱼类过敏与此蛋白相关[1]。小清蛋白是一种维持细胞内钙离子交换的钙结合蛋白，参与肌肉舒张的生理反应。分子量约为12kDa，等电点偏酸性，为3.9-5.5，具有高水溶性、耐热，耐酶解等特点，广泛分布于鱼类、两栖类和脊椎动物体内的肌浆蛋白中。不同鱼类白肉中小清蛋白的含量为红肉中的4-33倍。小清蛋白在高温和蛋白酶的作用下仍具有高稳定性，所以尽管在高温下烹煮和接触胃肠道蛋白酶，小清蛋白仍能使易感人群过敏[3]。目前已在国际免疫协会联盟(IUIS)过敏原资料库登记过的食物过敏原中属于鱼类来源者，均为小清蛋白家族成员。小清蛋白一般分为α和β两种不同的类型。α小清蛋白具有赖氨酸－丙氨酸(Lys-Ala)特征序列；而β小清蛋白的特征序列是丙氨酸－丙氨酸(Ala-Ala)[4]。α小清蛋白含有的酸性基酸残基比β小清蛋白少，因此，α小清蛋白的等电点高于β小清蛋白。在对Ca2+和Mg2+等阳离子的结合率上，β小清蛋白比α小清蛋白具有16％的Mg2+高亲和力，200％的Ca2+高亲和力。鱼类通常包含α和β两种小清蛋白，然而，大多数关于过敏原小清蛋白的报道都属于β系列。此外，大多数鱼含有两个或两个以上不同β小清蛋白亚型，分子量略有些差异，用β1、β2等表示[5]。甲壳类(虾/蟹)过敏原：甲壳类水产品的过敏原主要包括TM(Tropomyosin,原肌球蛋白)、AK(argininekinase,精氨酸激酶)、MLC(Myosinlightchain2,肌球蛋白2号轻链)、SCP(Sarcoplasmiccalciumbindingprotein,肌浆钙结合蛋白)和HCS(Hemocyaninsubunit血蓝蛋白亚基)。TM广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中，是细肌丝中与肌动蛋白的结合蛋白，在肌肉收缩中起重要作用，是虾、蟹类等甲壳类的主要过敏原。有学者对印度对虾(Penaeusin-dicus，Peni1)、棕虾(Penaeusaztecus，Pena1)、刀额新对虾(Metapenaeusensis，Mete1)等进行了研究，纯化并鉴定了肌肉组织中的主要过敏原TM。不同种类动物的TM虽然在分子结构上有所区别，但仍存在较强的免疫交叉反应，甲壳纲动物(虾、蟹、小龙虾、龙虾)TM，昆虫(蟑螂)TM，蛛纲类动物(尘螨)TM和一些软体动物TM之间均能够发生免疫交叉反应。目前，对虾蟹TM的研究相对较透彻，已在虾TM中鉴定出8个IgE结合位点，且每个结合位点的长度约为5～14个氨基酸残基；拟穴青蟹等主要过敏原TM同样有8个IgE结合位点，且和虾TM基本相同；AK是细胞代谢中调节磷酸精氨酸与ATP之间的能量平衡的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。其分子质量为40ku，由359个氨基酸残基组成，等电点为6.0。其空间结构较复杂，主要由一个N端的球形结构域和一个大的C端结构域组成，且在2个结构域中有2个高度保守的环。N端结构域全部由α-螺旋组成，而C端结构域则是由7个α-螺旋包绕8个反平行的β-折叠组成。AK作为过敏原，广泛存在于各种虾、蟹等甲壳类动物中，且在不同物种间有明显的交叉反应。最近研究表明，刀额新对虾、锯缘青蟹的过敏原AK经基因克隆和表达后，其重组蛋白仍具有免疫原性，且能与虾过敏患者阳性血清发生明显的免疫反应。MLC是肌小节粗肌丝的组成成分，可分为调节轻链(巯解轻链)和碱性轻链两类，其中调节轻链对肌球蛋白的结构与功能有着重要的调节作用。MLC蛋白质控制多个生理进程，包括参与物质运输、肌肉收缩和细胞分裂等。SCP是无脊椎动物体内一种EF手形钙离子缓冲蛋白，其与脊椎动物体内小清蛋白具有相似的调节肌肉收缩功能。软体动物(贝/蚌/蛤类，鱿鱼，章鱼)过敏原：TM同样是软体动物的主要过敏原。另外还有其他一些致敏性成分。以上三大类水产，虽然存在着一些特异性的致敏蛋白，但是将这些蛋白做到逐个分离比较困难。目前通用做法是从水产品中提取天然过敏原蛋白，然后将该蛋白直接用作过敏原检测的原料，本专利技术的天然过敏原原料购自GREER、IndoorBiotechnologies。目前国内医院检验科使用的进口品牌主要有德国敏筛公司(Mediwiss)，欧蒙公司(EUROIMMUN)，Phadia[6]等。其中，德国敏筛主要产品使用的是膜条免疫印迹检测法，但这其产品均未实现把鱼、甲壳类、软体动物类在同个膜条上检测；欧蒙也是膜条免疫印迹法，其只能检测鱼和甲壳类，但不能检测软体类；Phadia虽然检测项目齐全，但Phadia的试剂和仪器成本非常高，给患者带来不便。而本专利技术在同个芯片上实现水产类的联检，检测更具针对性，检测使用的血清较膜条免疫印迹法少(膜条法需要0.5ml以上的血清，本专利技术仅需200ul血清)，同时检测结果和进口品牌试剂符合性高，并且成本远低于进口品牌，故本专利技术相较市场上现有的产品具有很大优势。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术申请人提供了一种一次性检测3种常见水产类过敏原抗体的芯片及其制备方法。本专利技术芯片用于检测过敏原抗体，检出率高，无痛苦，无危险性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测常见水产类过敏原抗体的芯片，其特征在于所述芯片通过如下步骤制得：（1）黑玻片预处理；（2）点样过敏原蛋白溶液；（3）对芯片进行封闭，制得所述芯片。

【技术特征摘要】
1.一种检测常见水产类过敏原抗体的芯片，其特征在于所述芯片通过如下步骤制得：（1）黑玻片预处理；（2）点样过敏原蛋白溶液；（3）对芯片进行封闭，制得所述芯片。2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（1）中所述黑玻片预处理的方法为：①将黑玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16~24h，之后采用纯化水清洗2~8次；②将黑玻片置于质量浓度为0.05~1wt%的硅烷溶液中浸泡20~60min；③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100~180℃条件下烘烤0.2~0.6h。3.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（2）中所述过敏原蛋白溶液包括鱼、虾/蟹、软体类的过敏原蛋白溶液。4.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于步骤（2）中所述点样的方法为机器自动化点样，在黑玻片上点成4×7...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤迭尧，泮锋纲，丁俊杰，施启尧，
申请(专利权)人：江苏三联生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32