逆转录病毒的生产方法技术

本发明专利技术公开一种逆转录病毒生产方法，是采用鼠源细胞培养病毒，鼠源细胞的培养基的血清浓度在培养期间通过逐步递减，用含较低浓度血清的培养基更换逐步更换高浓度血清的培养基；每天收获病毒培养上清，并每天补充低浓度血清的培养基；收获的培养上清经低速离心后，直接采用高速离心获得病毒沉淀，重悬病毒沉淀，分装获得高浓度的病毒。本发明专利技术的方法，收获的病毒原液中宿主细胞成分含量低，血清成分含量低，且病毒培养的第一代结束后，将感染了病毒的细胞与未感染病毒的细胞混合，并传至新的培养瓶中，进行持续性的感染培养，不经细胞冻存复苏，培养周期快，每代可连续收获多次血清浓度低的病毒液，耗时短。

Production methods of retroviruses

The invention discloses a method for producing retrovirus, which adopts mouse-derived cell culture virus, and the serum concentration of the culture medium of mouse-derived cells decreases gradually during the culture period, replacing the culture medium containing lower serum concentration gradually with the medium containing higher serum concentration; harvesting the virus culture supernatant every day and supplementing the culture medium containing lower serum concentration every day; After low-speed centrifugation, virus precipitation was obtained by high-speed centrifugation directly, virus precipitation was suspended again, and high concentration virus was obtained by subassembly. The method of the invention has the advantages of low content of host cell component and low content of serum component in the harvested viral original solution, and after the first generation of viral culture is finished, the infected cells and the non-infected cells are mixed and transferred to a new culture bottle for continuous infection culture without freezing and resuscitation of the cells. The culture cycle is fast, and the serum concentration can be continuously harvested for many times in each generation. Low viral fluid, short time-consuming.

【技术实现步骤摘要】
逆转录病毒的生产方法
本专利技术属于生物
，特别是涉及一种病毒的生产方法。
技术介绍
为确保动物来源产品的安全性，国家相关法规要求需对产品的纯化生产工艺进行病毒清除灭活验证，通过加入模型病毒证明工艺可以清除或灭活一定对数值的病毒，即在病毒清除、灭活步骤将病毒掺入到样本中进行灭活，再用指示细胞检测具感染性病毒的变化值，或其他检测手段检测样品中病毒的残余量。(PointstoConsiderintheManufactureandTestingofMonoclonalAntibodyProductsforHumanUse,1997),(PointstoConsiderintheCharacterizationofCellLinesUsedtoProduceBiologicals,1993),(ICHQ5A(R1)掺入到样本中的病毒需满足两个条件，一是病毒中杂质含量低，以排除在感染性测试中非病毒可能导致的干扰、毒性，二是具感染性的病毒滴度高(大于7.0log10)，以满足病毒清除灭活要求的病毒对数下降值。模型病毒之一，逆转录病毒，为RNA包膜病毒，生产常用的细胞为Musdunni细胞和minklung细胞(MRLander,SKChattopadhyay.AMusdunnicelllinethatlackssequencescloselyrelatedtoendogenousmurineleukemiavirusesandcanbeinfectedbyectropic,amphotropic,xenotropic,andminkcellfocus-formingviruses.JVirol.1984November；52(2):695–698.)。也有报道使用CHO细胞(RongMa,Ming-GangBi,Xiao-LanCui.Growthcurveofmurinexenotropicleukemiavirus-relatedvirusgrowninChinesehamsterovarycells.JournaloftheChineseMedicalAssociation.2014January；77(1):44-48.)，(一种病毒原液的制备方法(申请号：CN201810584021))。用CHO细胞生产逆转录病毒，病毒导致细胞病变，导致病毒收获液中宿主细胞成分、及血清蛋白高，增加病毒浓缩纯化难度，病毒液中复杂的成分将对病毒清除验证中造成干扰。采用minklung细胞、Musdunni细胞，目前尚未建立持续性感染培养体系，难以持续获得大量病毒液，满足工业化的病毒清除验证对病毒的需求量。对生产的病毒原液进行浓缩，多采用离心法，传统病毒离心的方法为蔗糖密度梯度离心法或CsCl梯度离心法(T.E.O'Connor1,F.J.Rauscher1,R.F.Zeigel.DensityGradientCentrifugationofaMurineLeukemiaVirus.Science.1964May；144(3622):1144-1147)，(TadahiroNasukawaJumpeiUchiyamaEmailauthorSatoshiTaharaguchiSumireOtaTakakoUjiharaShigenobuMatsuzakiHironobuMurakamiKeijirouMizukamiMasahiroSakaguchi.ViruspurificationbyCsCldensitygradientusinggeneralcentrifugation.ArchivesofVirology.2017Nov；162(11):3523-3528)得到的病毒有蔗糖或CsCl残留，残留物质也易对病毒清除验证中造成干扰，因此，蔗糖密度梯度离心法获得病毒液后需再次用超高速离心以除去蔗糖，离心力达100000g，此超高离心力下，RNA包膜病毒表面的蛋白易被破坏，损失病毒活力(DoraSviben,DubravkoTihanaBeataHalassy,MarijaBrgles.Stability,biophysicalpropertiesandeffectofultracentrifugationanddiafiltrationonmeaslesvirusandmumpsvirus.ArchivesofVirology.2016June,161(6):1455–1467.)。CsCl梯度离心法获得的病毒液，需进行透析脱盐。两种方法耗时长，且准备工作繁琐。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，针对逆转录病毒生产，建立一种连续性感染培养体系，改良培养方法，持续性的获得宿主细胞成分少、血清含量低的病毒原液。在获得上述病毒原液的基础上，摸索出合适的离心条件，不添加蔗糖或CsCl，无残留，快速获得高浓度的病毒，病毒活力损失小。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种逆转录病毒生产方法，包括步骤：(1)采用鼠源细胞培养病毒，鼠源细胞的初始培养基中含8％-10％的胎牛血清；培养过程中调整血清浓度有个递减的过程。(2)待细胞生长好后，逐步用含较低浓度(3％-5％)胎牛血清的培养基更换含较高浓度血清的培养基，至少更换两次，待血清浓度低至2％及以下时，每天收获病毒培养上清。(3)收获的培养上清经低速(1000-3000rpm/min)离心后收集上清，再采用高速离心(15500-20000rpm/min)离心2-3小时，获得病毒沉淀；重悬病毒沉淀，分装获得高浓度的病毒。一种具体的实施方式中，所述方法还包括：步骤(4)病毒培养第一代结束后，不经细胞冻存复苏，将感染了病毒的鼠源细胞与未经病毒感染的细胞混合，并传至新的培养瓶中，采用与步骤(1)～(2)相同的培养方法开始下一代的病毒生产。一种具体的实施方式中，所述步骤1)中，所述鼠源细胞可以为Musdunni细胞。一种具体的实施方式中，所述步骤2)中，培养基更换次数可以为1次、2次、3次或更多次。一种具体的实施方式中，所述步骤2)中，培养基血清浓度的递减，递减的时间分别是在病毒培养以及病毒传代后的第二天、第五天。一种具体的实施方式中，所述步骤2)中，当血清浓度低至2％及以下时，每天收获病毒培养上清，并补充低浓度血清的培养基。一种具体的实施方式中，低速离心的转速为1000-3000rpm/min。一种具体的实施方式中，低速离心的时间为15-25min。一种具体的实施方式中，高速离心的转速为的15500-20000rpm/min。一种具体的实施方式中，高速离心的时间为2-3小时。与现有技术相比较，本专利技术具有以下优势：1.收获的病毒原液(病毒培养上清)中宿主细胞成分含量低，利于后续的病毒浓缩。采用鼠源细胞培养，病毒不使细胞产生病变，收获培养上清，与病毒致细胞病变裂解的培养方式相比，病毒原液中宿主细胞成分含量低。2.收获的病毒原液中血清成分含量低，利于后续的病毒浓缩。早期培养使用血清比例高的培养基，有利于细胞生长以及病毒成分在细胞中合成，随后逐步降低培养基中血清的浓度。更换为低浓度血清的培养基后，大量病毒释放到培养基中时收获病毒液，所获病毒液血清成分含量低，利于病毒浓缩。3.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种逆转录病毒生产方法，其特征在于，包括步骤：(1)采用鼠源细胞培养病毒，鼠源细胞的培养基的血清浓度有个递减的过程；(2)培养早期用较高浓度的血清，待细胞生长好后，逐步用含较低浓度血清的培养基更换含较高浓度血清的培养基，至少更换两次，待血清浓度低至2％时，每天收获病毒培养上清；(3)收获的培养上清经低速离心后收集上清，再采用高速离心获得病毒沉淀；重悬病毒沉淀，分装获得高浓度的病毒。

【技术特征摘要】
1.一种逆转录病毒生产方法，其特征在于，包括步骤：(1)采用鼠源细胞培养病毒，鼠源细胞的培养基的血清浓度有个递减的过程；(2)培养早期用较高浓度的血清，待细胞生长好后，逐步用含较低浓度血清的培养基更换含较高浓度血清的培养基，至少更换两次，待血清浓度低至2％时，每天收获病毒培养上清；(3)收获的培养上清经低速离心后收集上清，再采用高速离心获得病毒沉淀；重悬病毒沉淀，分装获得高浓度的病毒。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：步骤(4)病毒培养第一代结束后，不经细胞冻存复苏，将感染了病毒的鼠源细胞与未经病毒感染的细胞混合，并传至新的培养瓶中，采用与步骤(1)～(2)相同的培养方法开始下一代的病毒生产。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述鼠源细胞为Musdunni细胞。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：范洁，苏财忠，童涌，
申请(专利权)人：苏州药明康德检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32