一种同时检测牛源病毒和猪源病毒的检测方法技术

本发明专利技术公开一种同时检测牛源病毒和猪源病毒的检测方法，包括步骤：1)制备阴性对照组、阳性对照组和样品检测组；2)将所述阴性对照组、所述阳性对照组和所述样品检测组在进行孵育，并在不少于21天的培养过程内每周至少进行2次细胞形态变化的观察；3)进行血细胞吸附实验，观察细胞对红细胞的吸附情况；或进行细胞学染色实验，观察细胞形态变化；或进行免疫荧光实验，用于病毒感染检测。本发明专利技术通过对相关法规的合理解读及实验流程设计，将牛源病毒检测过程和猪源病毒检测过程合二为一，即一个检测过程同时对牛源及猪源病毒进行检测，在满足法规基本检测要求的前提下减少1/3以上的重复检测工作及实验物料。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测牛源病毒和猪源病毒的检测方法
本专利技术涉及生物检测领域，特别是涉及一种能够同时检测牛源病毒和猪源病毒的检测方法。
技术介绍
很多生物制品，包括表达的蛋白、病毒疫苗产品、基因治疗载体，都来源于细胞培养如杂交瘤细胞，转基因细胞系或原代培养细胞或细胞系。对一些生物制剂和体细胞疗法，细胞本身就是产品。细胞的生长和维持通常依赖于在生长培养基中的各种添加剂。猪源性胰酶被广泛用于组织或细胞消化。封闭饲养的洁净动物是保证动物无病原污染的最好方式，但，某些情况下这种方式是不可行的，因此，动物存在病毒感染最终会影响动物产品的安全性，纯度和功效。细胞的生长和维持通常依赖于在生长培养基中添加的各种补充剂。牛血清(胎牛或小牛)和其他血清制品，如牛血清白蛋白，可能是最常用的补充剂。牛血清通常是屠宰时收集的血清加工而成。虽然血液采集和血清处理方法在过去的几年里有明显的改善，但仍存在潜在的血清污染如细菌，真菌，支原体，病毒。许多血清在子宫内已被污染，因此可能含有某些致细胞病变和无细胞病变的病毒。培养基补充剂中存在外源污染物可能导致供试细胞系的感染，最终影响终产品的安全、纯度和效价。因此在使用哺乳动物细胞进行生物制品生产时，存在外源病毒污染的风险，这种污染可能会导致严重的临床后果。为此，相关法规(美国US9CFR113.52)对此做了相关规定，要求生产企业在临床试验被批准前以及生物制品释放前，生产流程的各个环节都必须通过安全测试。其中规定了若在生产过程中接触到牛源的FBS或猪源胰酶(Trypsin)，这类制品必须证明不存在任何外源污染物，需分别对生产用细胞进行牛源及猪源病毒检测。分开进行牛源及猪源病毒检测，耗时费力效率低。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种同时检测牛源病毒和猪源病毒的检测方法，操作简便，检测效率高，稳定性好。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种同时检测牛源病毒和猪源病毒的检测方法，包括步骤：1)制备阴性对照组、阳性对照组和样品检测组；所述阴性对照组是将指示细胞接种于基础培养基EMEM；所述阳性对照组是将指示细胞上接种对应的阳性对照病毒用于细胞病变观察；所述样品检测组是将指示细胞接种检测样品；2)将所述阴性对照组、所述阳性对照组和所述样品检测组在37±2℃、5±2％CO2湿度适当的条件下孵育，并在不少于21天的培养过程内每周至少进行2次细胞形态变化的观察；3)进行血细胞吸附实验，观察细胞对红细胞的吸附情况；或进行细胞学染色实验，观察细胞形态变化；或进行免疫荧光实验，用于病毒感染检测。在一种具体实施方式中，所述指示细胞包括Vero细胞，BT细胞，ST细胞。在一种具体实施方式中，在所述步骤2)之前，将所述阴性对照组、所述阳性对照组和所述样品检测组在37±2℃、5±2％CO2湿度适当的条件下孵育60-90分钟后，进行补液。在一种具体实施方式中，所述步骤2)中，观察细胞包涵体，细胞变圆，巨细胞的存在或数量异常，或其他由于外来物导致的细胞病理迹象。在一种具体实施方式中，所述步骤2)中，在第7天和14天进行传代。在一种具体实施方式中，在进行所述血细胞吸附实验前1-3天里，Vero细胞阴性对照接种副流感病毒3型(PI3)。在一种具体实施方式中，在第21天或之后，进行血细胞吸附实验：在每个细胞单层上分别加入0.2％的鸡和豚鼠的红细胞悬液，分别置于2-8℃和20-25℃孵育30-45分钟，然后通过肉眼及显微镜观察细胞对红细胞的吸附情况。在一种具体实施方式中，在第21天或以后，将细胞单层固定，然后进行细胞学染色，通过显微镜观察细胞形态变化。在一种具体实施方式中，在进行免疫荧光实验的前1-6天(因不同病毒而异)，在阴性对照和接种供试品的指示细胞上分别接种100-300感染单位的BVDV，BPV，BAV，BRSV，RV，PPV，TGE，HEV，和PAV。在一种具体实施方式中，在第21天或以后，准备细胞片(包括阴性对照组的细胞，样品检测组的细胞，病毒感染的供试品细胞(干扰对照)以及阳性对照组的细胞)并将其固定，用于后续的BVDV、BPV，BAV和BRSV免疫荧光检测；或用于后续的RV狂犬病毒和BTV，PPV，TGE，HEV，和PAV免疫荧光检测。本专利技术的基本步骤为：1)准备阴/阳性对照和标准品以及各类实验耗材；2)准备实验研究的批记录，摸索实验条件；3)进行实验研究，建立稳定的检测评价体系；4)完成检测体系的验证。本专利技术通过对相关法规的合理解读及实验流程设计，将牛源病毒检测过程和猪源病毒检测过程合二为一，即一个检测过程同时对牛源及猪源病毒进行检测。本专利技术的方法可以在满足法规基本检测要求的前提下减少1/3以上的重复检测工作及实验物料。附图说明图1为本专利技术的方法一具体实施方式的流程图。具体实施方式下面将对本专利技术的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1A:指示细胞的选择。选择对牛/猪病毒敏感度高的细胞作为指示细胞。可以选择(Vero，BT,ST)作为检测指示细胞。B:实验流程的设计。阴性对照租：指示细胞接种基础培养基EMEM。样品检测组：指示细胞上接种检测样品作为样品组。细胞病变阳性对照组：指示细胞上接种对应的阳性对照病毒作为细胞病变观察阳性对照。接种供试品后，将相应的细胞培养物(阴性对照、供试品和阳性对照)37±2℃、5±2％CO2湿度适当的条件下孵育60-90分钟后，进行补液。指示细胞接种供试品后，将在37±2℃、5±2％CO2湿度适当的条件下孵育，并在不少于21天的培养过程内每周至少进行2次细胞形态变化的观察。观察细胞包涵体，细胞变圆，巨细胞的存在或数量异常，或其他由于外来物导致的细胞病理迹象。接种后每过3到4天或根据需要为细胞更换培养液，在第7天和14天进行传代。在血细胞吸附实验前1-3天里，Vero细胞阴性对照接种副流感病毒3型(PI3)。在进行免疫荧光实验的前1-6天(因不同病毒而异)，在阴性对照和接种供试品的指示细胞上分别接种100-300感染单位的BVDV，BPV，BAV，BRSV，RV，PPV，TGE，HEV，和PAV。在第21天或之后，进行血细胞吸附实验：在每个细胞单层上分别加入0.2％的鸡和豚鼠的红细胞悬液，分别置于2-8℃和20-25℃孵育30-45分钟，然后通过肉眼及显微镜观察细胞对红细胞的吸附情况。在第21天或以后，将细胞单层固定，然后进行细胞学染色。通过显微镜观察细胞形态变化。在第21天或以后，准备细胞片(阴性对照细胞，供试品接种的细胞，病毒感染的供试品细胞(干扰对照)以及阳性对照)并将其固定，用于后续的BVDV、BPV，BAV和BRSV免疫荧光检测。用于后续的RV狂犬病毒和BTV，PPV，TGE，HEV，和PAV免疫荧光检测。C:对上述实验流程设计验证方案用以验证其可操作性，稳定性，及检测限和检测特异性。结果显示：检测结果有效：阴性对照组在整个检测周期内未观察到细胞病变，接种PrV病毒的Vero细胞表现细胞病变阳性，接种BVDV病毒的BT细胞表现细胞病变阳性结果。VERO阴性细胞接种PI3病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时检测牛源病毒和猪源病毒的检测方法，其特征在于，包括步骤：1)制备阴性对照组、阳性对照组和样品检测组；所述阴性对照组是将指示细胞接种于基础培养基EMEM；所述阳性对照组是将指示细胞上接种对应的阳性对照病毒用于细胞病变观察；所述样品检测组是将指示细胞接种检测样品；2)将所述阴性对照组、所述阳性对照组和所述样品检测组在37±2℃、5±2％CO2湿度适当的条件下孵育，并在不少于21天的培养过程内每周至少进行2次细胞形态变化的观察；3)进行血细胞吸附实验，观察细胞对红细胞的吸附情况；或进行细胞学染色实验，观察细胞形态变化；或进行免疫荧光实验，用于病毒感染检测。

【技术特征摘要】
1.一种同时检测牛源病毒和猪源病毒的检测方法，其特征在于，包括步骤：1)制备阴性对照组、阳性对照组和样品检测组；所述阴性对照组是将指示细胞接种于基础培养基EMEM；所述阳性对照组是将指示细胞上接种对应的阳性对照病毒用于细胞病变观察；所述样品检测组是将指示细胞接种检测样品；2)将所述阴性对照组、所述阳性对照组和所述样品检测组在37±2℃、5±2％CO2湿度适当的条件下孵育，并在不少于21天的培养过程内每周至少进行2次细胞形态变化的观察；3)进行血细胞吸附实验，观察细胞对红细胞的吸附情况；或进行细胞学染色实验，观察细胞形态变化；或进行免疫荧光实验，用于病毒感染检测。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述指示细胞选自Vero细胞，BT细胞，ST细胞。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤2)之前，将所述阴性对照组、所述阳性对照组和所述样品检测组在37±2℃、5±2％CO2湿度适当的条件下孵育60-90分钟后，进行补液。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，观察细胞包涵体，细胞变圆，巨细胞的存在或数量异常，或其他由于外来物导致的细胞病理迹象。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宇，苏财忠，童涌，范洁，赖燕燕，
申请(专利权)人：苏州药明康德检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32