一种固定细胞的方法及细胞固定试剂技术

本发明专利技术公开一种固定细胞的方法，是向待固定的细胞中加入固定试剂，该固定试剂为乙二醛固定液，该乙二醛固定液是pH为6.0～8.0、乙二醛质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。本发明专利技术还提供一种细胞固定试剂，是pH为6.0～8.0、乙二醛质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。本发明专利技术的方法和固定试剂的固定效果与4％多聚甲醛相当，且能更好的使细胞维持原有形态，避免细胞固定后变粗大，安全性好，试剂稳定性好，成本低。

A Method of Cell Fixation and Cell Fixation Reagent

The invention discloses a method for fixing cells by adding a fixing reagent to the cells to be fixed. The fixing reagent is glyoxal fixative solution. The glyoxal fixative solution is glyoxal solution with pH of 6.0-8.0 and mass percentage concentration of glyoxal of 1-5%. The present invention also provides a cell fixation reagent, which is a glyoxal solution with pH 6.0-8.0 and glyoxal mass percentage concentration 1-5%. The method and the fixing reagent of the invention have the same fixing effect as 4% paraformaldehyde, and can better keep the cell in its original shape, avoid the cell becoming thicker after fixing, have good safety, good stability of the reagent and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种固定细胞的方法及细胞固定试剂
本专利技术属于生物
，尤其是涉及一种用于固定细胞的新方法及细胞固定试剂。
技术介绍
4％多聚甲醛是国际通用的细胞固定试剂，固定效果好，已广泛使用了几十年，且一直没有合适的替代物。但是，多聚甲醛的安全性和毒性很令人担忧。多聚甲醛是一种易燃物，4％多聚甲醛有刺鼻的气味，对眼睛，皮肤和呼吸道有强烈的刺激，它可能引起皮肤过敏，哮喘，呼吸困难。如果接触到眼睛，可能使眼睛严重损伤，而且有致癌的潜在危害。实践中，目前的生物工艺的病毒清除验证中，病毒检测的方法通常是：先使细胞被病毒感染后，用细胞培养基和琼脂糖的凝胶混合物覆盖在细胞表面，在细胞培养箱里孵育一定的时间，然后固定细胞，磕掉琼脂糖凝胶，用0.5％结晶紫溶液染色。按照目前的工作需求，每天固定细胞的工作量大，需要固定细胞的数量为100～200块细胞培养6孔板，50～100块直径为15厘米的细胞培养皿。我们所使用的细胞固定试剂为4％多聚甲醛。由于4％多聚甲醛有刺鼻的气味，研究人员反映用4％多聚甲醛固定细胞，即使采取了在通风橱里操作，佩戴防毒面具等保护措施，也有头晕、头疼、胸闷、胸口痛、呼吸困难、过敏等不舒服的反应。部分研究人员发生了哮喘。个别情况中接触到眼睛，使眼睛严重损伤。更为令人担忧的是，4％多聚甲醛有致癌的潜在危害。从工作人员的健康出发，我们迫切需要一种固定效果能与4％多聚甲醛相当，且对人体健康危害小的新的固定方法及固定试剂。因此，本领域需要研究一种多聚甲醛的替代试剂以及一种固定细胞的新方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种固定细胞的方法，其固定效果能够与本领域最常用的4％多聚甲醛相当，但对人体健康危害大大降低。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种固定细胞的方法，包括：向待固定的细胞中加入乙二醛固定液；所述乙二醛固定液是pH为6.0～8.0、质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。在一种具体的实施例中，所述乙二醛固定液是将质量百分数为40％的乙二醛水溶液(w/w)稀释在PBS溶液里，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。在另一种具体的实施例中，所述乙二醛固定液是将质量百分数为40％的乙二醛水溶液(w/w)稀释在MilliQ超纯水里，加入适量冰醋酸，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。优选的，所述冰醋酸体积百分数终浓度为0.5～2％。在一种具体的实施例中，所述待固定的细胞是CV-1细胞(非洲绿猴肾细胞，Africangreenmonkeykidney)，PG4细胞(莫洛尼氏肉瘤转化猫星形脑胶质细胞，Moloneymurinesarcomavirustransformedglialastrocytefromnormalfeline)，324K细胞(人SV-40转化的成纤维细胞，HumanSV-40transformedfibroblast)或LLC-MK2细胞(恒河猴肾细胞，RhesusMonkeyKidney)。其中，CV-1细胞(非洲绿猴肾细胞，Africangreenmonkeykidney)、PG4细胞(莫洛尼氏肉瘤转化猫星形脑胶质细胞，Moloneymurinesarcomavirustransformedglialastrocytefromnormalfeline)、324K细胞(人SV-40转化的成纤维细胞，HumanSV-40transformedfibroblast)和LLC-MK2细胞(恒河猴肾细胞，RhesusMonkeyKidney)，分别被PrV(PseudorabiesVirus，伪狂犬病病毒)、X-MuLV(XenotropicMurineLeukemiaVirus，异嗜鼠白血病病毒)、MVM(MinuteVirusofMice，小鼠细小病毒)和Reo-3(Reovirustype3，呼肠孤病毒)四种病毒感染后，形成不同形状的空斑。在一种具体的实施例中，所述待固定的细胞是先用细胞培养基和琼脂糖的凝胶混合物覆盖在病毒感染后的细胞表面，然后在细胞培养箱里孵育一定的时间，再用于固定。在一种具体的实施例中，所述待固定的细胞是培养在细胞培养6孔板或直径为15厘米的细胞培养皿内。其中，对于细胞培养6孔板，每孔加入0.5～1.5mL乙二醛固定液；对于直径为15厘米的细胞培养皿，每个培养皿里加入5～10mL乙二醛固定液。在一种具体的实施例中，所述方法还包括步骤：加入乙二醛固定液之后，在室温常压下孵育1～5小时，然后去除覆盖在细胞表面的培养基-琼脂糖凝胶混合物，再加入0.5～1mL0.5％结晶紫溶液染色。另一方面，本专利技术还提供一种细胞固定试剂，所述细胞固定试剂为pH为6.0～8.0、质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。其中，一种优选的细胞固定试剂是，将质量百分数为40％的乙二醛水溶液(w/w)稀释在PBS溶液里，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。其中，一种优选的细胞固定试剂是，将质量百分数为40％的乙二醛水溶液(w/w)稀释在MilliQ超纯水里，加入适量冰醋酸，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。优选的，所述冰醋酸体积百分数终浓度为0.5～2％。本专利技术的方法与采用世界通用的固定黄金试剂4％多聚甲醛相比较，具有以下优点：1.1～5％乙二醛的固定效果与4％多聚甲醛相当。我们用乙二醛溶液固定324K、CV-1、PG4和LLC-MK2四种细胞，这四种细胞分别被MVM、PrV、X-MuLV和Reo-3四种病毒感染后，形成不同形状的空斑。与4％多聚甲醛相比较，所固定的细胞和形成的病毒空斑从形状，大小和数目上，均没有显著差异，说明两者的固定效果相当。2.虽然4％多聚甲醛是国际通用的细胞固定试剂，但是在324K细胞的固定中，我们观察到采用4％多聚甲醛会使细胞变粗大，像水肿一样；而采用本专利技术提供的1～5％乙二醛固定液能使324K细胞维持原有的形态，未观察到细胞变粗大，固定效果相比4％多聚甲醛更好。3.安全性高，无刺激性和致癌风险。4％多聚甲醛有刺鼻的气味，对眼睛、皮肤和呼吸道有强烈的刺激，有致癌的潜在危害。本专利技术使用的乙二醛水溶液没有任何气味。由于乙二醛溶液本身是不挥发的，且固定液中乙二醛浓度很低(1～5％)，实验操作都是在通风橱中进行，工作人员通过呼吸、皮肤等接触到的乙二醛非常非常有限。乙二醛溶液没有刺激性气味，本身毒性很小，我们的工作人员在使用乙二醛配制固定液或固定细胞时，即使不佩戴防毒面具，也从未有过敏或其他不适反应。所以，用乙二醛固定细胞是安全的。4.试剂稳定性好。本专利技术采用的1～5％的乙二醛固定液固定细胞，该固定液经实验室配制后至少可以有效使用一个月，试剂的稳定性好。5.使用乙二醛作细胞固定剂成本比4％多聚甲醛低很多。目前我们每天需要使用1000～2000mL4％多聚甲醛，试剂花费是500～1000元，而使用乙二醛固定只需60～120元。附图说明图1为用1～5％乙二醛和4％多聚甲醛分别固定324K细胞及病毒感染后形成的空斑的效果图，图中显示细胞和病毒空斑的固定效果一致。图2为用1～5％乙二醛和4％多聚甲醛分别固定CV-1细胞及病毒感染后形成的空斑的效果图，图中显示细胞和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种固定细胞的方法，其特征在于，向待固定的细胞中加入固定试剂，所述固定试剂为乙二醛固定液，所述乙二醛固定液是pH为6.0～8.0、乙二醛质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。

【技术特征摘要】
1.一种固定细胞的方法，其特征在于，向待固定的细胞中加入固定试剂，所述固定试剂为乙二醛固定液，所述乙二醛固定液是pH为6.0～8.0、乙二醛质量百分浓度为1～5％的乙二醛溶液。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙二醛固定液是将质量百分数为40％的乙二醛水溶液稀释在PBS溶液里，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙二醛固定液是将质量百分数为40％的乙二醛水溶液稀释在MilliQ超纯水里，加入适量冰醋酸，调节pH至6.0～8.0，调节乙二醛质量百分数终浓度为1～5％得到。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述冰醋酸体积百分数终浓度为0.5～2％。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待固定的细胞是CV-1细胞，PG4细胞，324K细胞或LLC-MK2细胞；其中，CV-1细胞、PG4细胞、324K细胞和LLC-MK2细胞分别被PrV、X-MuLV、MVM和Reo-3四种病毒感染。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待固定的细胞是先用细胞培养基和琼脂糖的凝胶混合物覆盖在病毒感染后的细胞表面，然后在细胞培养箱里孵育一定的时间，再用于固定。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷静，邱忆涛，高庆，阳俊容，刘海霞，王硕，
申请(专利权)人：苏州药明康德检测检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32