基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物及鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物及鉴定方法。本发明专利技术利用12个伞形科植物的叶绿体全基因组序列和道地川穹基因组序列进行对比，获得插入/缺失差异片段所设计的4对特异DNA引物，采用该引物来鉴定道地川芎，鉴定方法包括：提取待测样品的DNA；采用这4对引物对DNA进行扩增；对扩增产物进行凝胶电泳检测，若能同时扩增出4种引物对应的特异性条带，则为道地川穹。该鉴定方法简便，样品用量少，准确性高，速度快，更加适合应用于大批量的品种鉴定，在短时间内能精确鉴定道地川芎。

Primers and identification methods for authentic Chuanqin based on InDel markers

The invention provides a primer for authentic River dome identification and an identification method based on InDel marker. The invention uses 4 pairs of pairs of specific DNA primers designed by using 12 chloroplast genome sequences of the umbelate plants and the Dagu dome genome sequence to obtain the insertion / deletion difference fragments. The primer is used to identify the Chuanxiong Rhizoma Chuanxiong. The identification methods include: extracting the DNA from the tested sample; amplifying the DNA with these 4 pairs of primers; and detecting the amplified products by gel electrophoresis. The specific bands corresponding to the four primers can be amplified simultaneously, which is the authentic River dome. The method is simple, accurate and fast. It is more suitable for variety identification in large quantities and can accurately identify genuine Ligusticum Chuanxiong in a short time.

【技术实现步骤摘要】
基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物及鉴定方法
本专利技术属于川穹鉴定方法
，具体涉及一种基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物及鉴定方法。
技术介绍
川芎(Ligusticumchuanxionghort)为伞形科藁本属植物，以干燥的根入药。其根茎含有藁本内酯、川芎嗪、阿魏酸、挥发油等多种有效药用成分，具有活血行气，祛风止痛之功效。主要用于治疗月经不调、经闭痛经、产后瘀滞腥痛、症瘕肿块、胸胁疼痛等。由于其疗效显著、用量极大，作为大宗药材，备受关注。四川、江西、云南、吉林、甘肃、贵州等省都有川芎分布。四川省川芎产量丰富，药效价值高，为川芎道地产区，其中都江堰、彭州、崇州市是主产区，产量占全国产量的90％以上。省农业厅调查统计2016年全省川芎种植面积达10万亩以上。随着大健康产业发展的深入和人们对中医药认识的不断提高，我国中药产业对中药材的需求不断增加，很多中药材的市场价格不断上升，当中药材生产不能完全满足市场需求的时候，部分易混品流入市场，充当正品中药材，严重影响其疗效。如川产川芎疗效好，市场价格稳定，随着川芎产品开发的深入，市场对川芎的需求越来越大，也出现了部分易混品在市场上充当川芎售卖，如抚芎、云芎、东川芎等。道地药材与非道地药材来源一致或十分相近，在形态、生物药性及化学成分等特征上也具有高度相似性，导致道地药材的鉴别不易。因此迫切地需要研究利用新的方法提高道地川芎的鉴别能力。DNA条形码鉴定技术为中药材的物种鉴定研究提供了方便快捷的方法，DNA条形码(DNAbarcoding)是利用短的，标准的DNA序列来鉴定物种的新技术。DNA条形码技术可有效的将不同种、属之间的物种进行鉴别，且其操作的简便性和高效性推动物种鉴定与进化研究的发展，为解决中药行业对中药材基原物种鉴定的需求，有研究分析了中国川芎和日本川芎的ITS和matK序列，探讨中、日了川芎物种间鉴别，其结果显示中、日川芎关系，ITS测序难以区分中国川芎和日本川芎。更有试验通过ITS2研究了川芎与羽苞藁本等藁本属的遗传差异。但在对川芎进行ITS2测序时发现，川芎ITS2序列的杂合度高，存在插入缺失的现象，难以直接测序，上述标记均不满足DNA条形码基本特征。目前研究中所采用的材料种类较少，并无市场中川芎常见的混伪品品种如抚芎、云南藁本等，并且少有结合道地川芎药材的研究报道。另外，在上述研究中所使用的多为常见通用条形码，缺乏开发新条形码的创新性研究，缺少关于市场上道地川芎及其混伪品问题的有效解决方法。普通用于鉴定植物的DNA条形码，由于片段长度的限制，单一序列或多序列组合的条形码在物种鉴定特别是针对近缘物种之间的鉴定存在很大的局限性。叶绿体普遍存在于植物中，而相对于核基因组以及线粒体基因组，叶绿体基因组大多为母系遗传，进化速率较慢，序列较为保守。植物叶绿体基因组作为筛选DNA条形码序列的研究热点，其本身也可以作为超级条形码用于系统进化、亲缘关系以及物种鉴定研究。根据叶绿体基因组中的插入缺失位点，设计一些扩增这些插入缺失位点的PCR引物，就是cpInDel标记(叶绿体插入/缺失多态性ChloroplastInsertion/DelectionpolymorphismcpInDel)。有学者通过在15个小麦(Triticumaestivum)野生近缘属种基因组DNA的扩增分析发现11对InDel标记引物。也有研究发现在B73玉米(Zeamays)全基因组序列中发现13个共显性InDel标记，利用这些共显性InDel标记可以进行快速准确的玉米杂交种纯度鉴定。通过比较2种粳稻(Oryzasalivasubspkeng)的基因组序列，设计出634对InDel候选标记，可以在涉及籼粳亚种的基因定位和分子育种中应用。但是对于川芎的InDel标记尚未见相关研究。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物及鉴定方法，通过开发的4对特异性引物用以鉴定道地川芎及其常见混伪品，可高效、准确、可靠地得到鉴定结果。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物，包括：CINP3：F:5’-TCTGACACTGCACAAACAGGA-3’；R:5’-CATCTTAGGCGGATAGCGGG-3’；CINP5：F:5’-TTCTTGCCAGAGGAATGGTCC-3’；R:5’-GGTTGAAGATCACGAGGCGT-3’；CINP19：F:5’-ACGTAGCAGACATGCGGATT-3’；R:5’-CGCTGAAGCCGCTATTGGA-3’；CINP22：F:5’-AAAGCACTCGCTTTTCGCTG-3’；R:5’-ACAGCCGTTCTAAACCCGAA-3’。采用上述引物对道地川穹进行鉴定的方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品的DNA；(2)采用上述引物对提取的DNA进行扩增；(3)对扩增产物进行凝胶电泳检测，若能同时扩增出4种引物对应的特异性条带，则为道地川穹。进一步地，从待测样品的新鲜叶片组织中提取DNA。进一步地，扩增体系为20μl，包括：DNA2μl、上下游引物各2μl、ddH2O6μl、2×TaqPCRMasterMix10μl；扩增程序：95℃预变性5min，95℃变性1min30s，58℃复性30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸10min。本专利技术提供的基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物及鉴定方法，具有以下有益效果：本专利技术利用12个伞形科植物的叶绿体全基因组序列和道地川穹基因组序列进行对比，获得插入/缺失差异片段所设计的4对特异DNA引物，采用该引物来鉴定道地川芎，可根据引物扩增的特异性条带进行判断，即是否能够同时扩增出这4种引物对应的特异性条带，就能确定待测样品是否是道地川穹，该方法简便，样品用量少，准确性高，适合应用于大批量的品种鉴定，并在短时间内能精确鉴定道地川芎。附图说明图1为道地川芎及其混伪品种的聚类图。具体实施方式实施例11、实验材料本专利技术选取了藁本属的26个物种为材料，具体信息如下表：2、InDel引物设计从GenBank数据库中，下载12个伞形科植物的叶绿体全基因组序列，通过Mafft在线比对软件进行比对，在细叶藁本的叶绿体全基因组序列上，找到插入(IN)缺失(DEL)位点，在InDel位点两侧设计引物，引物长度大于20bp，以25bp为最优选择，Tm为50℃-60℃，以56℃为最优选择，GC含量为55％-60％之间，PCR产物大小在100-500bp之间。伞形科植物GenBank登录号如下表：名称拉丁学名Genbank登录号细叶藁本LigusticumtenuissimumNC_029394.1有喙欧芹AnthriscuscerefoliumNC_015113.1阿尔泰柴胡BupleurumfalcatumNC_027834.1大齿山芹OstericumgrosseserratumNC_028618.1东当归AngelicaacutilobaNC_029391.1白芷AngelicadahuricaNC_029392.1朝鲜当归AngelicagigasNC_029393.1野胡萝卜Da本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物，其特征在于，包括：CINP3：F:5’‑TCTGACACTGCACAAACAGGA‑3’；R:5’‑CATCTTAGGCGGATAGCGGG‑3’；CINP5：F:5’‑TTCTTGCCAGAGGAATGGTCC‑3’；R:5’‑GGTTGAAGATCACGAGGCGT‑3’；CINP19：F:5’‑ACGTAGCAGACATGCGGATT‑3’；R:5’‑CGCTGAAGCCGCTATTGGA‑3’；CINP22：F:5’‑AAAGCACTCGCTTTTCGCTG‑3’；R:5’‑ACAGCCGTTCTAAACCCGAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种基于InDel标记的道地川穹鉴定用引物，其特征在于，包括：CINP3：F:5’-TCTGACACTGCACAAACAGGA-3’；R:5’-CATCTTAGGCGGATAGCGGG-3’；CINP5：F:5’-TTCTTGCCAGAGGAATGGTCC-3’；R:5’-GGTTGAAGATCACGAGGCGT-3’；CINP19：F:5’-ACGTAGCAGACATGCGGATT-3’；R:5’-CGCTGAAGCCGCTATTGGA-3’；CINP22：F:5’-AAAGCACTCGCTTTTCGCTG-3’；R:5’-ACAGCCGTTCTAAACCCGAA-3’。2.采用权利要求1所述引物对道地川穹进行鉴定的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张超，熊淼，余小芳，袁灿，彭芳，陶珊，周永红，高素萍，李西，雷霆，
申请(专利权)人：四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所，四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川,51