用于鉴定小麦春化基因VRN-D4的试剂盒及其专用成套引物对制造技术

本发明专利技术公开了用于鉴定小麦春化基因VRN‑D4的试剂盒及其专用成套引物对。本发明专利技术用于鉴定VRN‑D4基因的成套引物对由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成；所述引物对乙由序列3所示的单链DNA分子和序列4所示的单链DNA分子组成。本发明专利技术针对VRN‑D4基因编码区第367位碱基变异重新设计1个CAPS标记，使扩增的目的片段内只含有一个限制性内切酶的酶切位点，以便达到缩短酶切时长和降低试剂成本的目的。本发明专利技术开发了该基因更加简便、快速、可靠、实用的分子标记，对小麦育种、引种和推广具有重要意义。

A Kit for Identification of Vernalization Gene VRN-D4 in Wheat and Its Primer Pairs

The invention discloses a kit for identifying Wheat Vernalization gene VRN D4 and a special primer pair. The present invention is used to identify VRN D4 gene. The primer pair consists of primer pair A and primer pair B. The primer pair A is composed of single-stranded DNA molecule shown in sequence 1 and single-stranded DNA molecule shown in sequence 2. The primer pair B is composed of single-stranded DNA molecule shown in sequence 3 and single-stranded DNA molecule shown in sequence 4. The present invention redesigns a CAPS marker for the 367th base mutation in the coding region of VRN D4 gene, so that only one restriction enzyme digestion site is contained in the amplified target fragment, so as to shorten the digestion time and reduce the reagent cost. The invention develops a molecular marker of the gene which is more convenient, fast, reliable and practical, and has important significance for wheat breeding, introduction and popularization.

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定小麦春化基因VRN-D4的试剂盒及其专用成套引物对
本专利技术属于生物
，具体涉及用于鉴定小麦春化基因VRN-D4的试剂盒及其专用成套引物对。
技术介绍
近百年来，全球气候正在经历着一次以变暖为主要特征的显著变化，气候变化已成为当今科学界、各国政府和社会公众强烈关注的重大环境问题之一。小麦是我国乃至世界上重要的粮食作物之一，气候变化给小麦的育种和生产工作提出了新的挑战和机遇。培育和推广能够适应外界环境变化、最大限度利用光热资源的品种，是夺取小麦高产和稳产的最经济最有效途径。通过调整小麦生长发育阶段使其更好的适应外界生长环境条件，只有这样才能够最大限度地降低作物减产风险从而确保小麦丰产。研究认为，不同地理气候条件下小麦生长发育适应性主要受春化基因(VRN)、光周期基因(PPD)及早熟基因(EPS)控制，其中春化基因对小麦生长发育适应性影响最大，贡献率约占70-75％。在冬小麦的生长发育进程中，必须要经历一段时期的低温处理，才能够抽穗开花，这个过程叫春化作用。小麦的春化作用是由四种春化基因VRN1、VRN2、VRN3和VRN4控制。与野生型等位变异相比，春化基因特定区域序列变异的等位变异使小麦品种的冬春习性发生改变，不同春化基因型决定小麦冬春习性强弱程度差异，使得完成春化过程所需低温时间也就不同，造成生长发育的进程不同，具备不同的生长习性，表现出小麦品种不同的抗冻害特性。已有研究表明，不同国家或地区的小麦具有不同春化基因组成类型，不同的春化基因组成类型与不同地区自然环境有关，是小麦适应环境能力的遗传基础，即不同国家或地区推广的小麦品种具备特定春化基因的组成类型。早在2000年Iwaki等就报道，中国小麦存在VRN-D4基因；随后Zhang等(2008)研究也证实我国小麦存在VRN-D4基因。Kippes等(2015)认为VRN-D4是小麦重要的春化基因之一，其可以增加小麦遗传的多样性，增强小麦适应不同生态地区和气候变化能力。与前三个春化基因VRN1、VRN2和VRN3相比，VRN4的研究相对滞后，近年来在小麦5D染色体上才克隆了VRN4基因，被命名为VRN-D4基因。该基因与SSR的分子标记Xcfd78和Xbarc205紧密连锁，与Xcfd67和BG313707标记存在共分离现象，此共分离标记常被用来作为VRN-D4基因的鉴定标记使用，但在实际检测过程当中发现有些材料却无法使用共分离标记得到有效的鉴别。进一步研究发现，VRN-D4其实是VRN-A1基因的1个拷贝基因，起源于小麦的5AL大片段插入5DS、所插入的片段中恰好包含了1个VRN-A1基因，只是在第一内含子区域和编码区第四外显子区域存在有两个功能结构域的变异。因此，前人对VRN-D4基因进行鉴定的时候，需要同时检测5DS区域是否存在5AL大片段的插入和编码区是否存在特定碱基的变异。与VRN-A1基因序列相比，VRN-D4基因在第1内含子区域存在有3个邻近的特异性SNP(G2780C、T2783C、C2784T)，而此位点区域正好属于一个开花抑制因子TaGRP2识别的保守区域RIP-3，由于该区域SNP多态性的改变使得开花抑制因子TaGRP2无法与该基因结合，导致携带春化基因VRN-D4小麦能够提早抽穗开花。同时，与VRN-A1序列相比，VRN-D4基因在第四外显子上第367位碱基存在有1个单碱基突变(A367C)，该处碱基的变化会导致氨基酸序列的变化(由原来的赖氨酸变成谷氨酰胺)，而此位点属于MADS转录因子的K-Box结构域，与植物生长发育进程密切相关。Kippes等(2015)设计了5对引物用于VRN-D4基因的鉴定，其中4对引物用于鉴定5DS区域是否存在5AL大片段的插入，1对CAPS引物用于鉴定编码区特定SNP位点的鉴定。但在实际生产当中，当有大量样本需要进行检测时，每个样品均需要进行至少5次PCR扩增和1次限制性酶切才能最终确定结果，这为小麦育种工作带来了诸多的不便。另外Kippes等开发的CAPS标记扩增的PCR产物中存在有两个限制性内切酶的酶切位点，实际鉴定过程中需要加倍的酶量及足够多的酶切时长才能够保证鉴定效果，而且多个酶切位点的存在有时候对结果判读也会存在一定的干扰。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何简便、快速、低成本且准确的鉴定小麦春化基因VRN-D4。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于鉴定VRN-D4基因的成套引物对。本专利技术提供的用于鉴定VRN-D4基因的成套引物对由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由VRND4-in1F和VRND4-in1R组成；所述引物对乙由dA367C-F和dA367C-R组成；所述VRND4-in1F为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述VRND4-in1R为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述dA367C-F为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述dA367C-R为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。为了解决上述技术问题，本专利技术又提供了上述成套引物对的新用途。本专利技术提供了上述引物对在如下c1)-c6)中任一种中的应用：c1)制备鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因的产品；c2)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；c3)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的产品；c4)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；c5)制备小麦育种的产品；c6)小麦育种。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了含有上述成套引物对的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下d1)-d3)中任一种：d1)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；d2)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；d3)小麦育种。上述试剂盒还可包括如下试剂：用于提取基因组DNA的试剂、用于PCR扩增的试剂和用于酶切的试剂。具体的，所述用于提取基因组DNA的试剂可包括2×CTAB缓冲液、氯仿异戊醇混合液、异丙醇、乙醇；所述用于PCR扩增的试剂可包括2×EsTaqMasterMix、无菌双蒸水；所述用于酶切的试剂可包括BstNI限制性内切酶、10×BufferR、Nuclease-free水。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的方法。本专利技术提供的鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的方法包括如下步骤：e1)以待测小麦的基因组DNA为模板，分别采用权利要求1中所述的引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到PCR产物甲和PCR产物乙；e2)用BstNI限制性内切酶酶切所述PCR产物乙，得到酶切产物；电泳检测所述PCR产物和所述酶切产物判定待测小麦是否携带VRN-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定VRN‑D4基因的成套引物对，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由VRND4‑in1F和VRND4‑in1R组成；所述引物对乙由dA367C‑F和dA367C‑R组成；所述VRND4‑in1F为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述VRND4‑in1R为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述dA367C‑F为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述dA367C‑R为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。

【技术特征摘要】
1.用于鉴定VRN-D4基因的成套引物对，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由VRND4-in1F和VRND4-in1R组成；所述引物对乙由dA367C-F和dA367C-R组成；所述VRND4-in1F为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述VRND4-in1R为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述dA367C-F为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述dA367C-R为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。2.权利要求1所述的成套引物对在如下c1)-c6)中任一种中的应用：c1)制备鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因的产品；c2)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；c3)制备鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因的产品；c4)鉴定或辅助鉴定待测小麦是否携带VRN-D4基因；c5)制备小麦育种的产品；c6)小麦育种。3.含有权利要求1所述的成套引物对的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下d1)-d3)中任一种：d1)鉴定或辅助鉴定VRN-D4基因；d2)鉴定或辅助鉴定待测...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈东升，张晓科，李瑞博，亢玲，张维军，哈东，李哲，何进尚，王小亮，张富国，
申请(专利权)人：宁夏农林科学院农作物研究所宁夏回族自治区农作物育种中心，
类型：发明
国别省市：宁夏,64