基于离线2D LC-MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于离线2D LC‑MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，包括以下步骤：S01，供试品溶液的制备：称取三七叶样品粉末适量，置于离心管中，加入相当于三七叶样品粉末质量80~100倍量的70%甲醇，室温超声提取至少30 min后进行一次离心，取上清液进行二次离心，二次离心的上清液于3~4℃保存待分析。本发明专利技术提供的一种基于离线2D LC‑MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，将代谢物预测的方法与HILIC×RP离线二维液相系统相结合，提出“离线二维分离‑扩展数据库匹配”的策略，对三七叶中的皂苷成分进行靶向表征，从而阐明其化学物质基础，为其相关制剂的质量控制提供依据。

【技术实现步骤摘要】
基于离线2DLC-MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法
本专利技术涉及一种基于离线2DLC-MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，属于化学成分分析方法

技术介绍
化合物库筛选是中药质谱鉴定常用的方法。化合物库中收录的化合物多基于分离文献报道，数目有限，从而限制了数据库匹配的效率。因此，扩展数据库中的化合物数目对中药复杂成分的快速鉴定至关重要。三七叶总皂苷制剂七叶神安片收录于2015版《中国药典》，具有益气安神、活血止痛的功效，临床上用于心气不足、心血瘀阻所致的心悸、失眠、胸痛、胸闷。三七分离报道多集中于三七根，对三七叶的研究较少。三七皂苷的主要差别在于苷元、糖基及酰化官能团类型和数目不同。本专利技术拟采用代谢物预测的方法，基于已报道的糖基和酰化官能团，对数据库中的皂苷进行理论的结构修饰，从而扩展化合物数据库。结合本专利技术已构建的HILIC×RP离线二维液相系统，提出“离线二维分离-扩展数据库匹配”的策略，对三七叶中的皂苷成分进行靶向表征，从而阐明其化学物质基础，为其相关制剂的质量控制提供依据。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，本专利技术提供一种基于离线2DLC-MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，该法将代谢物预测的方法与HILIC×RP离线二维液相系统相结合，提出“离线二维分离-扩展数据库匹配”的策略，对三七叶中的皂苷成分进行靶向表征，从而阐明其化学物质基础，为其相关制剂的质量控制提供依据。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：基于离线2DLC-MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，包括以下步骤：S01，供试品溶液的制备：称取三七叶样品粉末适量，置于离心管中，加入相当于三七叶样品粉末质量80～100倍量的70％甲醇，室温超声提取至少30min后进行一次离心，取上清液进行二次离心，二次离心的上清液于3～4℃保存待分析；S02，第一维分段供试品制备：第一维HILIC分离在Agilent1200液相系统上进行，使用的色谱条件如下：流动相包括水(A)和乙腈(B)；色谱柱WatersXBridgeAmide，规格为4.6×150mm,3.5μm；吸收波长：203nm；柱温25℃；进样量20μL；洗脱梯度：0-20min,85-75％(B)；20-21min,75-50％(B)；21-26min,50％(B)；1-24min每隔1min收集为1个流分，共收集23个流分，重复进样5针，将得到的流份用干燥的氮气吹干，每个样品溶于100μL的70％甲醇，于14000rpm进行离心10min，取上清液作为待测样品；S03，UPLC/QTOF-FastDDA条件：对经过第一维HILIC分离得到的23个样品进行第二维的UPLC/QTOF-MS检测；色谱柱为BEHshieldRPC18柱，规格为2.1×100mm,1.7μm，柱温为25℃；使用乙腈(A)和0.1％甲酸水(B)作为流动相，使用如下的梯度进行洗脱：0-3min,23-29％(A)；3-6min,29-31％(A)；6-10min,31-34％(A)；10-13min,34-53％(A)；13-16min,53-60％(A)；16-17min,60-95％(A)；17-20min,95％(A)；20-20.5min,95-23％(A)；20.5-24min,23％(A)；流速为0.3mL/min，进样量为2μL，PDA检测器设置检测波长为203nm；使用Waters公司的XevoG2-SQTOF高分辨质谱仪，配有ESI源，负离子模式检测；优化的源参数为：SourceVoltage,2.5kV；Conevoltage,60V；SourceOffsetVoltage,60V；Sourcetemperature,120℃；Desolvationtemperature,400℃；Conegasflow,30L/h；Desolvationgasflow,800L/h；使用FastDDA模式获取三七皂苷的二级质谱碎片：MS一级扫描范围m/z500-1500,扫描时间0.15s，当TIC强度超过5000intensity/sec时自动切换到MS/MS扫描；MS/MS二级扫描范围m/z150-1300；前3强离子自动选为母离子进行MS/MS裂解，MS/MS扫描时间0.15s，当单一离子强度高于5000intensity/s或者时间过去0.45s时切换到MS扫描；排除m/z500-700以避免触发产生的多电荷离子二级碎片；使用去同位素峰的峰识别模式-宽度窗口为±3Da,提取峰的范围为7Da；使用双动态的裂解能量-低质量端裂解能量为25V-45V，高质量端的裂解能量为60V-80V；再进行数据采集，数据采集格式为continnum，LE采集但不校正；S04，UNIFI数据处理：数据采用UNIFI进行处理；三七中分离报道的99个皂苷成分的化学信息，包括名称，分子式，结构导入UNIFI构建三七皂苷化合物库进行代谢物预测；编辑四个转化官能团，包括丙二酰基，葡萄糖，五碳糖和鼠李糖，并限定最多进行两步结构转化；一级MS和二级MS/MS阈值分别设定为300和100counts；匹配误差阈值设为5ppm；加合离子选择[M–H]-和[M–H+FA]-。S01中，一次离心的条件为：转速为4000rpm，时间为10min。S01中，二次离心的条件为：转速为14000rpm，时间为10min。S04中，丙二酰基为Mal,+C3H2O3,86.0004Da；葡萄糖为Glc,+C6H10O5,162.0528Da；五碳糖为Xyl,+C5H8O4,132.0423Da；鼠李糖为Rha,+C6H10O4,146.0579Da。S03中，数据采集的方法为使用MassLynx4.1软件进行采集。S04中，UNIFI的型号为v.1.8.2，厂家为Waters。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术针对中药数据库筛选中化合物数目有限的问题，我们基于UNIFI自动化数据处理模块，提出了代谢物预测方法，对已有数据库进行扩展。选择丙二酰基、葡萄糖、鼠李糖和木糖作为代谢物修饰的官能团，经过两步修饰，将三七数据库中的化合物数目扩充14倍。另外，结合离线二维液相分离，最终从三七叶中筛选出721个皂苷成分，结合“unknown”中鉴定的224个成分，共鉴定了945个成分。与常规的一维分离结合数据库筛选方法相比，二维液相分离结合扩展数据筛选中，化合物筛选数目扩大了7.5倍。通过检索人参属自建数据库，其中662个皂苷被确定为潜在的新化合物。该研究系统表征了三七叶中的皂苷成分，为其相关制剂的化学物质基础阐明提供了依据，同时扩展了当前对人参属皂苷结构多样性的认识。以上基于UNIFI软件的代谢物预测方法大大简化了数据处理流程，提高了质谱鉴定效率，也可推广应用于其它类别化合物的质谱表征中。附图说明图1为本专利技术中50个皂苷成分对照品化学结构；图2为本专利技术中离线二维系统的正交性评价图；图3为本专利技术中直接一维液质分析和4个分段样品的5个9.73min左右的质谱图；图4为本专利技术中化合物739在一维和二维分离中的一级与二级谱图；图5为4个C17侧链杂化型皂苷的一级和二级谱图及归属图；图6为本专利技术中化合物695的一级与二级质谱图。具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于离线2D LC‑MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，其特征在于：包括以下步骤：S01，供试品溶液的制备：称取三七叶样品粉末适量，置于离心管中，加入相当于三七叶样品粉末质量80～100倍量的70％甲醇，室温超声提取至少30min后进行一次离心，取上清液进行二次离心，二次离心的上清液于3～4℃保存待分析；S02，第一维分段供试品制备：第一维HILIC分离在Agilent 1200液相系统上进行，使用的色谱条件如下：流动相包括水(A)和乙腈(B)；色谱柱Waters XBridge Amide，规格为4.6×150mm,3.5μm；吸收波长：203nm；柱温25℃；进样量20μL；洗脱梯度：0‑20min,85‑75％(B)；20‑21min,75‑50％(B)；21‑26min,50％(B)；1‑24min每隔1min收集为1个流分，共收集23个流分，重复进样5针，将得到的流份用干燥的氮气吹干，每个样品溶于100μL的70％甲醇，于14000rpm进行离心10min，取上清液作为待测样品；S03，UPLC/QTOF‑Fast DDA条件：对经过第一维HILIC分离得到的23个样品进行第二维的UPLC/QTOF‑MS检测；色谱柱为BEH shield RP C18柱，规格为2.1×100mm,1.7μm，柱温为25℃；使用乙腈(A)和0.1％甲酸水(B)作为流动相，使用如下的梯度进行洗脱：0‑3min,23‑29％(A)；3‑6min,29‑31％(A)；6‑10min,31‑34％(A)；10‑13min,34‑53％(A)；13‑16min,53‑60％(A)；16‑17min,60‑95％(A)；17‑20min,95％(A)；20‑20.5min,95‑23％(A)；20.5‑24min,23％(A)；流速为0.3mL/min，进样量为2μL，PDA检测器设置检测波长为203nm；使用Waters公司的Xevo G2‑S QTOF高分辨质谱仪，配有ESI源，负离子模式检测；优化的源参数为：Source Voltage,2.5kV；Cone voltage,60V；Source Offset Voltage,60V；Source temperature,120℃；Desolvation temperature,400℃；Cone gas flow,30L/h；Desolvation gas flow,800L/h；使用Fast DDA模式获取三七皂苷的二级质谱碎片：MS一级扫描范围m/z 500‑1500,扫描时间0.15s，当TIC强度超过5000intensity/sec时自动切换到MS/MS扫描；MS/MS二级扫描范围m/z 150‑1300；前3强离子自动选为母离子进行MS/MS裂解，MS/MS扫描时间0.15s，当单一离子强度高于5000intensity/s或者时间过去0.45s时切换到MS扫描；排除m/z 500‑700以避免触发产生的多电荷离子二级碎片；使用去同位素峰的峰识别模式‑宽度窗口为±3Da,提取峰的范围为7Da；使用双动态的裂解能量‑低质量端裂解能量为25V‑45V，高质量端的裂解能量为60V‑80V；再进行数据采集，数据采集格式为continnum，LE采集但不校正；S04，UNIFI数据处理：数据采用UNIFI进行处理；三七中分离报道的99个皂苷成分的化学信息，包括名称，分子式，结构导入UNIFI构建三七皂苷化合物库进行代谢物预测；编辑四个转化官能团，包括丙二酰基，葡萄糖，五碳糖和鼠李糖，并限定最多进行两步结构转化；一级MS和二级MS/MS阈值分别设定为300和100counts；匹配误差阈值设为5ppm；加合离子选择[M–H]‑和[M–H+FA]‑。...

【技术特征摘要】
1.基于离线2DLC-MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，其特征在于：包括以下步骤：S01，供试品溶液的制备：称取三七叶样品粉末适量，置于离心管中，加入相当于三七叶样品粉末质量80～100倍量的70％甲醇，室温超声提取至少30min后进行一次离心，取上清液进行二次离心，二次离心的上清液于3～4℃保存待分析；S02，第一维分段供试品制备：第一维HILIC分离在Agilent1200液相系统上进行，使用的色谱条件如下：流动相包括水(A)和乙腈(B)；色谱柱WatersXBridgeAmide，规格为4.6×150mm,3.5μm；吸收波长：203nm；柱温25℃；进样量20μL；洗脱梯度：0-20min,85-75％(B)；20-21min,75-50％(B)；21-26min,50％(B)；1-24min每隔1min收集为1个流分，共收集23个流分，重复进样5针，将得到的流份用干燥的氮气吹干，每个样品溶于100μL的70％甲醇，于14000rpm进行离心10min，取上清液作为待测样品；S03，UPLC/QTOF-FastDDA条件：对经过第一维HILIC分离得到的23个样品进行第二维的UPLC/QTOF-MS检测；色谱柱为BEHshieldRPC18柱，规格为2.1×100mm,1.7μm，柱温为25℃；使用乙腈(A)和0.1％甲酸水(B)作为流动相，使用如下的梯度进行洗脱：0-3min,23-29％(A)；3-6min,29-31％(A)；6-10min,31-34％(A)；10-13min,34-53％(A)；13-16min,53-60％(A)；16-17min,60-95％(A)；17-20min,95％(A)；20-20.5min,95-23％(A)；20.5-24min,23％(A)；流速为0.3mL/min，进样量为2μL，PDA检测器设置检测波长为203nm；使用Waters公司的XevoG2-SQTOF高分辨质谱仪，配有ESI源，负离子模式检测；优化的源参数为：SourceVoltage,2.5kV；Conevoltage,60V；SourceOffsetVoltage,60V；Sourcetemperature,120℃；Desolvationtemperature,400℃；Conegasflow,30L/h；Desolvationgasflow,800L/h；使用Fast...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴婉莹，果德安，侯晋军，金青浩，雷敏，龙华丽，屈华，姚帅，姚长良，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31