一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及其应用，涉及种质鉴定技术领域，本发明专利技术所述构建方法首先分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。本发明专利技术所述构建方法选用9对假俭草SSR分子标记构建指纹图谱，可简便有效地对不同种质来源的假俭草进行区分，经济实用、稳定可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及应用
本专利技术涉及种质鉴别
，尤其涉及一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法及其应用。
技术介绍
假俭草在植物分类学上属于单子叶植物纲(Moncotyledoneae)，禾本目(Graminales)，禾本科(Gramineae)，蜈蚣草属(Eremochloa)，是该属中唯一可用作草坪草的优良暖季型C4草本植物。假俭草主要分布于中国长江流域及以南地区，中国中南部为其天然分布中心，它以耐瘠薄、病虫害少及养护水平低而著称，是国内外公认的起源于中国的最好草坪草，有“中国草坪草”(Chineselawngrass)的美誉。作为乡土草种，假俭草具有良好的观赏与应用价值，非常符合当前国内外草坪产业的发展趋势，是现代城市园林绿化和景观生态建设的优选草种。中国拥有全球最丰富的假俭草种质资源，这些种质资源覆盖了假俭草的分布范围(20°02′～34°36′N、98°36′～120°34′E，海拔0～1460m)，且其分布地域及生境条件各异，从而为假俭草种质资源的遗传基础研究和品种选育提供了得天独厚的优越性。为今后能更好、更便捷地开发利用中国丰富的假俭草资源，首先要做的就是对不同来源的假俭草种质进行鉴定和甄别。早期，人们多采用形态学的方法对假俭草种质材料进行鉴定，即根据其外部特征以及田间表现来识别不同品种材料。这些方法具有操作简单、相对经济的优点，但鉴定周期长，还易受环境、栽培技术、鉴定者的经验等因素影响，并且随着育种亲本利用集中化，通过形态差异进行假俭草品种鉴定愈来愈困难。近年来，包括同工酶电泳、蛋白质电泳、高效液相色谱等内容的生物化学检测方法，逐渐被应用到植物品种鉴定中来。该技术具有简便、快速、分辨力高、受环境影响小等优点。不过蛋白质具有表达的组织特异性和发育的阶段性，因此，取样部位或时间不一致都会带来误差，影响鉴定工作；而且同工酶一般要从幼苗或生长期的植株中提取，也需一定的鉴定周期；另外可利用的同工酶和所揭示的位点都比较有限，较难区分细小差异。随着生物技术的飞速发展，基于分子标记技术而建立起来的DNA指纹图谱(fingerprint)在品种、品系鉴别方面发挥着重要作用。品种DNA指纹数据库的构建在一些作物品种纯度及真实性鉴定、种子质量标准化、品种审定及产权登记保护、真假种辨别、品种纠纷等方面具有重要应用价值，在探究某一作物种质资源的亲缘关系、杂种优势群划分、种质资源创新利用及新品种选育等方面发挥着显著作用。当前用于构建植物DNA指纹图谱的标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。简单重复序列(Simplesequencerepeat，SSR)，是第二代基于PCR技术的分子标记技术，具有多态性丰富、遗传信息多、操作便利、共显性、高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物资源遗传研究和分子辅助育种实践中。DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。为了有效保护中国假俭草种质资源和品种知识产权，急需要在中国开展假俭草微卫星标记开发，并应用于假俭草优良品种“分子身份证”构建的研究。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有假俭草不同种质资源之间的鉴定方法不足的问题，提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，可更好地开展假俭草种质资源鉴定，保护地方品种、发掘新种质，并弥补传统鉴定方法的不足，且能用最简化的标记对野生和新创制种质进行准确、经济、快速的鉴定。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；(2)以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18中的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；(3)将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。优选的，所述步骤(2)中，(ACA)5的引物如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；(CTG)11的引物如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示；(GAG)10的引物如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；(CTG)12的引物如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；(CCT)7的引物如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示；(CTC)11的引物如SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示；(ATC)14的引物如SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示；(CTC)10的引物如SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示；(CTAC)18的引物如SEQIDNo.17和SEQIDNo.18所示。优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增使用的体系每10μL，包括：5μL2xTaqPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、1.5μL基因组DNA模板和2.5μL超纯水；所述上游引物或下游引物浓度独立地为10μmol/L，基因组DNA模板浓度为30ng/μL。优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，10个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸7min。优选的，所述步骤(3)中，所述将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码：将各样品的PCR扩增结果中，有扩增目的产物的计作“1”、无扩增目的产物的计作“0”、缺失该SSR分子标记位点计作“9”，转化为依次排列的矩阵，得到计算机可识别的假俭草种质鉴定的指纹图谱。优选的，所述步骤(1)中，假俭草样品包括全球统一编号为E004、E006、E013、E015、E017、E019、E022、E041、E042、E047、E055、E061、E063、E065、E072、E074、E077、E078、E084、E087、E091、E092-1、E097、E098、E099、E112、E115、E124、E131、E134、E135、E141、E144、E145、E152、E154、E155、E182、E183、E187、E188、E102和E158的假俭草。本专利技术提供了上述技术方案所述的构建方法在区分不同种质来源的假俭草中的应用。优选的，按照上述技术方案所述的构建方法得到假俭草的指纹图谱，以构建所述指纹图谱时采用的SSR分子标记(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18的一种或多种的引物对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增结果在指纹图谱中的位置，判断待测样品的种质来源。本专利技术取得的有益效果：本专利技术提供了一种假俭草种质的指纹图谱的构本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；(2)以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18中的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；(3)将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。

【技术特征摘要】
1.一种假俭草种质的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)分别提取不同种质来源的假俭草样品的基因组DNA；(2)以各假俭草样品的基因组DNA为模板，以(ACA)5、(CTG)11、(GAG)10、(CTG)12、(CCT)7、(CTC)11、(ATC)14、(CTC)10和(CTAC)18中的一种或多种SSR分子标记的引物分别进行PCR扩增；(3)将各样品的PCR扩增结果转化为计算机可识别的数码，得到假俭草种质鉴定的指纹图谱。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，(ACA)5的引物如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；(CTG)11的引物如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示；(GAG)10的引物如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；(CTG)12的引物如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示；(CCT)7的引物如SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示；(CTC)11的引物如SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示；(ATC)14的引物如SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示；(CTC)10的引物如SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示；(CTAC)18的引物如SEQIDNo.17和SEQIDNo.18所示。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增使用的体系每10μL，包括：5μL2xTaqPCRMasterMix、上下游引物各0.5μL、1.5μL基因组DNA模板和2.5μL超纯水；所述上游引物或下游引物浓度独立地为10μmol/L，基因组DNA模板的浓度为30ng/μL。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增的程序为：95...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建建，刘建秀，宗俊勤，汪毅，郭海林，陈静波，李丹丹，李玲，王晶晶，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32