一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合，包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种，其中第一引物组由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列组成，第二引物组由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的序列组成，第三引物组由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列组成，第四引物组由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示的序列组成。本发明专利技术的引物组合重复性好，特异性高。本发明专利技术还公开了利用上述引物组合鉴定镰刀菌菌种的方法，准确性高，操作简单，适用于镰刀菌菌种的快速鉴定。

A Primer Combination and Method for Rapid Identification of Fusarium Species

The invention discloses a primer combination for rapid identification of Fusarium species, including at least one of the first primer group, the second primer group, and/or at least one of the third primer group and the fourth primer group, in which the first primer group is composed of SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.2 sequences, and the second primer group is composed of SEQ ID NO.1 and SEQ ID NO.3 sequences. The third primer group consisted of SEQ ID NO.4 and SEQ ID NO.5 sequences, and the fourth primer group consisted of SEQ ID NO.4 and SEQ ID NO.6 sequences. The primer combination of the invention has good repeatability and high specificity. The invention also discloses a method for identifying Fusarium species by using the combination of primers, which has high accuracy, simple operation and is suitable for rapid identification of Fusarium species.

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法
本专利技术属于分子生物学实验
，具体地，涉及一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合及方法。
技术介绍
镰刀菌(Fusariumspp.)在无性时期属于半知菌亚门，有性时期属于子囊菌亚门。目前，已发现的镰刀菌不少于44种。镰刀菌属于兼寄生或腐生生活，在全世界分布广泛，可动植物有机体上生长，会引起植物的根、茎和花等组织的腐烂，严重影响了粮食、经济作物以及药用植物的产量和品质，具有较高的危害性。镰刀菌属是真菌中较大的一个属，为丝状真菌，广泛分布于自然界中。镰刀菌可以侵染多种植物，如粮食作物、油料作物、经济作物等，造成严重的产量损失。镰刀菌及其引起的病害防控一直是国内外的研究热点。随着全球气候的变化及耕作制度的改变，频繁的国际贸易活动、适宜的温湿度、广泛的传播途径和有利的寄主等使得镰刀菌迅速地跨地区传播，镰刀菌的种群结构在全球范围内发生了显著变化。镰刀菌种类鉴定是开展其生物多样性研究、病害防控及植物检验检疫等工作的基础，开发镰刀菌鉴定新方法是目前的迫切需求。由于镰刀菌种类多，分布广，传统的形态学分类方法很难准确对其进行鉴定，利用分子生物学的技术，从分子层面对镰刀菌进行鉴定，不仅速度快，而且鉴定结果准确，为镰刀菌的分类研究提供有效方法。不同种类镰刀菌翻译延伸因子基因(translationelongationfactor1α，TEF)具有高度的保守性，TEF基因测序比对分析能准确鉴定镰刀菌，目前已建立了专门的镰刀菌TEF基因序列数据库。以前有研究者基于里氏木霉(Trichodermareesei)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)的TEF基因序列(GenBank检索号分别为Z23012和U14100)设计了用于扩增丝状真菌TEF基因的简并引物对：EF-1(5'-ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC-3')和EF-2(5'-GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT-3')(O'DonnellK.,KistlerH.C.,CigelnikE.,PloetzR.MultipleevolutionaryoriginsofthefunguscausingPanamadiseaseofbanana:concordantevidencefromnuclearandmitochondrialgenegenealogies.PNAS,1998,95:2044-2049，在此全文引入作为参考)，该引物对在大多数丝状真菌鉴定中起到很好的作用。但是，利用引物对EF-1/2进行镰刀菌基因组扩增时经常出现扩增失败或有杂带的情况，说明该引物对的使用具有一定的局限性，可能对某些菌种不适用。值得注意的是，引物对EF-1/2是根据里氏木霉(Trichodermareesei)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)的基因序列设计开发的，引物设计的位置可能在镰刀菌基因组中是不保守的。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，专利技术人对10种镰刀菌的TEF基因序列进行比对分析，结果发现，意外地发现，引物EF-1第15位碱基C在多数镰刀菌基因组中为G，这说明引物EF-1并不适用于多数镰刀菌。因此，本专利技术通过对不同种镰刀菌TEF基因序列比对分析，找到保守序列，设计了高特异性扩增镰刀菌TEF基因的引物对，通过对扩增片段进行测序，然后进行数据库比对分析，从而完成本专利技术对镰刀菌准确鉴定的目的。为此，本专利技术一方面提供了一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合，包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种，其中，第一引物组包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物TEF-1F和具有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的下游引物TEF-2R；第二引物组包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物TEF-1F和具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的下游引物TEF-3R；第三引物组包括具有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的上游引物EF-LF1和具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的下游引物EF-LR1；第四引物组包括具有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的上游引物EF-LF1和具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的下游引物EF-LR2。在本专利技术一些实施方案中，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组。在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组。在本专利技术的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第三引物组。在本专利技术的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第四引物组。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第二引物组。在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第三引物组和第四引物组。在本专利技术的一些实施方案中，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第三引物组。在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第四引物组。在本专利技术的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组和第三引物组，在本专利技术的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组和第四引物组。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第二引物组和第三引物组。在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第二引物组和第四引物组。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组、第三引物组和第四引物组。在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述引物组包括第二引物组、第三引物组和第四引物组。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组包括第一引物组、第二引物组、第三引物组和第四引物组。在本专利技术的实施方案中，如果引物组合中同时包括第一引物组和第二引物组，或同时包括第三引物组和第四引物组，则其中共有上游引物的含量或浓度是下游引物的至少2倍。本专利技术的第二方面提供一种快速鉴定镰刀菌菌种的方法，包括以下步骤：获取待鉴定镰刀菌的基因组DNA；以所述DNA为模板，利用本专利技术第一方面的引物组合进行PCR扩增；将扩增产物进行凝胶电泳检测，并将目标PCR产物进行测序；将测序结果通过BLAST比对，如果测序结果的序列与参考镰刀菌的相似性不低于98％，则该待鉴定镰刀菌与参考镰刀菌属于同一种。其中，相似性不低于98％例如98％、99％、100％。在本专利技术一些实施方案中，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组。在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第二引物组。在本专利技术的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第三引物组。在本专利技术的又一些具体实施方案中，所述引物组合包括第四引物组。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述引物组合包括第一引物组和第二引物组。在本专利技术的另一些具体实施方案中，所述引物组合包括第三引物组和第四引物组。在本专利技术的一些实施方案中，所述引物组合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种，其中，所述第一引物组包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物TEF‑1F和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的下游引物TEF‑2R；所述第二引物组包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的上游引物TEF‑1F和具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的下游引物TEF‑3R；所述第三引物组包括具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的上游引物EF‑LF1和具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的下游引物EF‑LR1；所述第四引物组包括具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的上游引物EF‑LF1和具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的下游引物EF‑LR2。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴定镰刀菌菌种的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和/或选自第三引物组、第四引物组中的至少一种，其中，所述第一引物组包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物TEF-1F和具有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的下游引物TEF-2R；所述第二引物组包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物TEF-1F和具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的下游引物TEF-3R；所述第三引物组包括具有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的上游引物EF-LF1和具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的下游引物EF-LR1；所述第四引物组包括具有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的上游引物EF-LF1和具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的下游引物EF-LR2。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的至少一种，和选自第三引物组、第四引物组中的至少一种。3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括选自第一引物组、第二引物组中的一种，和选自第三引物组、第四引物组中的一种。4.一种快速鉴定镰刀菌菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤：获取待鉴定镰刀菌的基因组DNA；以所述DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合进行PCR扩增；将扩增产物进行凝胶电泳检测，并将目...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，刘玉洋，张静雅，赵志勇，杨俊花，杨宪立，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海,31