一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种靶向PRIM1基因的干扰RNA、慢病毒载体及其应用，所述RNA干扰序列能够抑制肿瘤细胞的生长，由其构建的的慢病毒载体能够抑制PRIM1基因在mRNA水平的表达，可以用于制备抗肿瘤药物，为后续深入研究PRIM1基因在肿瘤形成中具体的作用机制提供了一种切实有用的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用。
技术介绍
随着人类生活习惯和行为模式的改变，以及工农业发展过程带来的环境污染和人口老龄化等原因，恶性肿瘤成为人类致死是主要疾病。世界卫生组织国际癌症中心的最新数据显示恶性肿瘤在全球的发病率呈上升趋势，其中64％发生在发展中国家。在我国，肿瘤防治面临的形式也极为严峻，最新报告显示，在过去30年间，我国恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈明显上升趋势。因此，对肿瘤的研究是生命科学和医学领域的持续研究热点之一。近年来发展了许多针对肿瘤的基因治疗方法的研究，但迄今为止进入临床应用的几种基因药物的临床疗效有限，且具有潜在的、长期的、延迟的副作用，因此，寻求治疗的新靶点已成为国内外肿瘤基因治疗的研究方向。肿瘤细胞的DNA启动点的研究是目前肿瘤研究的热点区域，DNA合成酶主要作用是开始细胞(包括肿瘤细胞)DNA的合成。真核细胞核DNA引物合成酶含有两个亚基，及PRIM1和PRIM2。PRIM1是异四倍体真核生物多醚菌素α引物酶合成物最小亚基，其单独携带有酶的催化作用和引物的延伸作用，然而PRIM2没有这些酶的活性作用。在整个细胞周期，PRIM1基因的mRNA的表达水平是随着催化的进程不断调整的，没有PRIM1的催化作用，DNA的复制是无法进行的，PRIM1基因突变影响细胞循环周期G1到S期过渡，所以PRIM1基因在细胞(包括肿瘤细胞)的整个形成过程中扮演非常重要的角色。目前已有PRIM1基因在膀胱癌、乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤细胞中的报道，但至今尚未有PRIM1基因在肿瘤形成中具体作用机制的报道，本实验以PRIM1基因为模板，构建其RNA干扰慢病毒载体，供后续深入研究PRIM1基因在肿瘤行程中具体的作用机制。慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1来源的一种慢病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染和稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体包装系统主要的组成部分。携带有外源性基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、包装细胞系的辅助下，经过慢病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在体细胞或活体组织中长久的表达。载体构建的原理是将病理基因组中的顺式作用元件与编码反式蛋白的序列进行分离，慢病毒载体中除了留下必须的反式作用元件和包装信号，其余病毒序列均被外源基因替代。慢病毒载体广泛用于基础研究与临床研究，已经成为真核系统基于转移的有力工具，常用于人类疾病的基因治疗、癌变模型等研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决上述现有技术的缺点和不足，提供一种靶向PRIM1基因的RNA干扰、慢病毒载体及其应用。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种靶向PRIM1基因的干扰RNA序列，其核苷酸序列如下：正义链：5’-CCGGGCCCTTGTTCCTGAAACAATTCTCGAGAATTGTTTCAGGAACAAGGGCTTTTTG-3’，即SEQIDNO.5；反义链：5’-AATTCAAAAAGCCCTTGTTCCTGAAACAATTCTCGAGAATTGTTTCAGGAACAAGGGC-3’，SEQIDNO.6。本专利技术还包括一种含有权利要求1所述RNA干扰序列的慢病毒表达载体。进一步地，所述慢病毒载体由SEQIDNO.5和SEQIDNO.6退火形成双链，然后经AgeI和EcoRI酶切位点连入GV115慢病毒表达质粒而得。本专利技术还包括所述RNA干扰序列的制备方法，包括如下步骤：所述SEQIDNO.5和SEQIDNO.6退火形成双链，然后经AgeI和EcoRI酶切位点连入GV115慢病毒表达质粒，包装，转染，获得慢病毒颗粒，然后将慢病毒颗粒转染至宿主细胞中表达获得RNA干扰序列。进一步地，所述宿主细胞为BEL-7404细胞。本专利技术还包括所述RNA干扰序列或权利要求2或3所述慢病毒表达载体在抑制肿瘤生长中的应用。本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术获得了有效抑制肿瘤细胞的RNA干扰序列。2.本专利技术构建的的慢病毒载体能够抑制PRIM1基因在mRNA水平的表达。3.本专利技术的shRNA序列以及由其构建的载体是抑制肿瘤生长的有效手段，可以用于制备抗肿瘤药物。4.本专利技术为后续深入研究PRIM1基因在肿瘤行程中具体的作用机制提供了一种切实有用的方法。为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本专利技术。附图说明图1是慢病毒表达载体GV115载体图谱。图2是载体线性化后目的片段的琼脂糖凝胶电泳图片。泳道1:1kbMarker：从上到下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：AgeI和EcoRI双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒。图3是RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图。图4是RNA干扰载体阳性克隆鉴定的琼脂糖凝胶电泳图片。泳道1：阴性对照(ddH2O)，排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；泳道2：自连对照(空载体自连对照组)；泳道3:250bpMarker：从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4-8：单克隆psc45862-1，2，3，4，5。图5是PRIM1-RNAi慢病毒侵染BEL-7404细胞后，PRIM1的mRNA表达水平显著降低。具体实施方式实施例1:PRIM1基因慢病毒载体的制备技术路线为：从Genbank中调取人PRIM1基因序列；预测shRNA位点；完成RNA干扰靶点设计后，合成含干扰序列的单链DNAoligo，退火配对产生双链DNA；随后通过其两端酶切位点直接连入酶切后的慢病毒载体；将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性重组子，送测序验证，对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提。1.实验材料1.1实验质粒载体编号：GV115(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)元件顺序：hU6-MCS-CMV-EGFP对照插入序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT1.2实验菌株TOP10大肠杆菌感受态细胞(TIANGEN,Cat.#CB104-03)1.3实验试剂1.3.1酶类试剂1.3.2其他试剂1.3.3实验仪器1.4实验室试剂的配制1.4.1退火缓冲液(PH＝7.5-8.0)1.4.2LB液体培养基(100ml，PH＝7.0)1.4.3LB固体培养基(100ml，PH＝7.0)含氨苄青霉素的LB培养基中氨苄青霉素的含量为100μg/ml。2.RNA干扰靶点设计及双链DNAoligo制备2.1基因信息2.2RNA干扰靶点设计根据RNA干扰序列设计原则，以PRIM1基因为模板，设计多个19-21ntRNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。2.3DNAoligo序列合成根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3′端添加TTTTT终止信号,而反链5′端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNAoligo。＊CCGG：AgeI酶切位点；AATTC：EcoRI酶切位点；G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向PRIM1基因的干扰RNA序列，其特征在于，核苷酸序列如下：正义链：5’‑CCGGGCCCTTGTTCCTGAAACAATTCTCGAGAATTGTTTCAGGAACAAGGGCTTTTTG‑3’，即SEQ ID NO.5；反义链：5’‑AATTCAAAAAGCCCTTGTTCCTGAAACAATTCTCGAGAATTGTTTCAGGAACAAGGGC‑3’，即SEQ ID NO.6。

【技术特征摘要】
1.一种靶向PRIM1基因的干扰RNA序列，其特征在于，核苷酸序列如下：正义链：5’-CCGGGCCCTTGTTCCTGAAACAATTCTCGAGAATTGTTTCAGGAACAAGGGCTTTTTG-3’，即SEQIDNO.5；反义链：5’-AATTCAAAAAGCCCTTGTTCCTGAAACAATTCTCGAGAATTGTTTCAGGAACAAGGGC-3’，即SEQIDNO.6。2.一种含有权利要求1所述RNA干扰序列的慢病毒表达载体。3.根据权利要求2所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述慢病毒载体由SEQIDNO.5和SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢海，
申请(专利权)人：卢海，
类型：发明
国别省市：广东,44