用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组、试剂盒、反应体系及系统技术方案

本发明专利技术涉及用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组、试剂盒、反应体系及系统。本发明专利技术所述探针组由探针1、探针2和探针3组成，其中，所述探针1、探针2和探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、6和7所示，所述探针1、探针2和探针3的两端分别标记淬灭染料和荧光染料，所述探针1标记荧光染料1，所述探针2和探针3均标记荧光染料2。本发明专利技术所述探针组、试剂盒、反应体系和检测系统能够实现T790M和C797S顺反式突变的准确检测，具有可定量、灵敏度高、特异性好、检测限低的优点。另外，本发明专利技术所述探针组、试剂盒、反应体系和检测系统还能够在不增加反应数和其他实验的情况下，对待测样本直接进行质量控制。

Probe sets, kits, reaction systems and systems for detecting cis-trans mutations in T790M and C797S

The invention relates to a probe group, a kit, a reaction system and a system for detecting the cis-trans mutation types of T790M and C797S. The probe group consists of probe 1, probe 2 and probe 3. The nucleotide sequences of probe 1, probe 2 and probe 3 are shown as SEQ ID NO:3, 6 and 7. The two ends of probe 1, probe 2 and probe 3 are labeled with quenched dyes and fluorescent dyes respectively. The probe 1 labels fluorescent dyes 1, and both probe 2 and probe 3 label fluorescent dyes 2. The probe set, reagent kit, reaction system and detection system of the invention can realize accurate detection of cis-trans mutations of T790M and C797S, and has the advantages of quantification, high sensitivity, good specificity and low detection limit. In addition, the probe group, the kit, the reaction system and the detection system can also directly control the quality of the tested samples without increasing the number of reactions and other experiments.

【技术实现步骤摘要】
用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组、试剂盒、反应体系及系统
本专利技术涉及数字PCR领域，具体而言，涉及用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组、试剂盒、反应体系及系统。
技术介绍
EGFR基因T790M和C797S突变是在肿瘤患者中发现的基因突变类型，EGFR基因T790M具体是指表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)第20号外显子第790氨基酸位点由苏氨酸(T)突变为甲硫氨酸(G)，基因水平表现为c.2369C>T；EGFR基因C797S具体是指EGFR第20号外显子第797氨基酸位点由半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)，基因水平表现为c.2389T>A或c.2390G>C。当T790M和C797S同时突变时，T790M和C797S位于相同等位基因上，这种构型称为顺式；T790M和C797S位于不同等位基因上，这种构型称为反式。目前研究结果表明，T790M、C797S突变及不同构型与肿瘤患者的耐药性、疗效预测、预后相关，例如：当EGFR基因C797S和T790M为反式突变时，临床上运用一代和三代EGFR-TKI联合治疗有效。而当C797S和T790M为顺式突变时，肿瘤对所有EGFR-TKI均耐药。在诸如血液的体液样本中检测T790M、C797S突变及构型具有显著的优势，适用于肿瘤标本不可评估(较难通过手术或穿刺获得肿瘤组织)的患者，并在一定程度上有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测。因此，检测T790M、C797S突变及构型，尤其是检测体液样本诸如血液中的T790M、C797S突变及构型，无论是在临床还是在科研上均具有重要意义。目前EGFRT790M、C797S突变顺式、反式检测方法包括二代测序(NGS)和数字PCR法(dPCR)。其中NGS方法检测灵敏度为0.2％-1％且其检测周期长、费用高；市场上基于数字PCR法检测EGFRT790M、C797S突变顺式、反式灵敏度为0.1％，但该方法无法计算突变率且无法在同一反应中进行样本的质控。由此可见，目前需要一种检测灵敏度高、检测周期短、可以准确获得T790M和C797S顺反式突变类型和突变率(包括顺式、反式突变率)且可以直接对样本进行质控的方法。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组。本专利技术的第二目的在于提供用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的数字PCR试剂盒。本专利技术的第三目的在于提供用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的数字PCR反应体系。本专利技术的第四目的在于提供用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的系统。本专利技术所述探针组、试剂盒、数字PCR反应体系和检测系统，基于所述探针1～3对T790、C797的突变型、野生型的不同结合强度以及数字PCR技术的特征，能够实现对样本T790M和C797S顺反式突变类型的准确、定量检测以及对待测样本进行质量控制；另外，本专利技术所述试剂盒集成前述探针组和数字PCR的其他试剂集，便于产品的运输、保存和使用以及产品的推广、应用。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组，所述探针组由探针1、探针2和探针3组成，其中，所述探针1、探针2和探针3的核苷酸序列如SEQIDNO：3、6和7所示，所述探针1、探针2和探针3的两端分别标记淬灭染料和荧光染料，所述探针1标记荧光染料1，所述探针2和探针3均标记荧光染料2。本专利技术上述探针组由探针1～3组成，所述探针1～3具有以下特点：(1)探针1～3均为兼容性探针，其中，探针1既可以结合T790野生型模板又可以结合T790M(c.2369C>T)突变型模板，探针2既可以结合C797野生型模板又可以结合C797S(c.2389T>A)突变型模板，探针3既可以结合C797野生型模板又可以结合C797S(c.2390G>C)突变型模板；(2)探针1～3对野生型模板的结合能力明显低于突变型模板，其在数字PCR反应中对野生型模板与突变型模板的区分度好，能够准确反应野生型模板拷贝数和突变型模板拷贝数；(3)探针2～3在同一PCR反应中不会相互干扰，能准确检出C797S(c.2389T>A)、C797S(c.2390G>C)突变拷贝数。基于上述探针1～3所示特点，本专利技术所述探针组能够应用于数字PCR技术，实现T790M和C797S顺反式突变类型的准确、定量检测以及质量监控待测样本，具体而言：首先，基于探针1～3的兼容性、区分性以及非干扰性，前述探针组应用于数字PCR时，能够在同一反应单元中同时检测单拷贝模板的T790和C797是否发生T790M、C797S突变，继而根据该反应单元的检测结果确定所述单拷贝模板T790M和C797S顺反式突变类型。如果所述反应单元的检测结果同时为T790M突变阳性和C797S突变阳性且连锁，散点分布于散点图的右上区，则判断所述样本为顺式突变；如果其检测结果同时为T790M突变阳性和C797S突变阳性且2种突变型的散点分布于散点图的左上区和右下区，则判断所述样本为反式突变，如果其检测结果均为T790M突变阴性和C797S突变阴性，则可确定该样本为野生型。其次，基于数字PCR，可以实现不同突变类型的反应单元的计数，获得待测样本的总拷贝数以及顺、反式突变类型的拷贝数，从而计算获得顺、反式突变的突变率。再者，基于样本的总拷贝数，在不增加反应数和其他实验的情况下，可以对待测样本直接进行质量控制，例如，如果检测出各模板总拷贝数大于等于1500，说明提取的cfDNA合格；反之，说明提取的cfDNA不合格。最后，实施例记载的检测结果显示：对于20ng样品可以检出0.05％突变率的样本；对于拷贝数为1300～1500的cfDNA样本，本专利技术所述探针组的顺式检测限为0.4％，反式各突变检测限为0.5％；对于拷贝数为5500-7000的cfDNA样本，顺式检测限为0.1％；反式C797S突变检测限为0.1％，T790M突变检测限为0.1％-0.2％。同时，本专利技术所述探针组对C797S、T790M分析的灵敏度均为100％，构型一致率、顺式突变一致率、反式突变一致率和顺式+反式突变一致率均为100％，C797S分析特异性为97.6％，T790M分析特异性为100％。在一些具体的实施方式中，所述探针1～3为Taqman探针。在一些具体的实施方式中，所述荧光染料1为VIC，所述荧光染料2为FAM。在一些具体的实施方式中，所述探针组为单试剂、双试剂或三试剂；可选地，所述探针组为双试剂，包括试剂1和试剂2，其中，试剂1包括探针1，试剂2包括探针2和探针3。另一方面，本专利技术还涉及用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的数字PCR试剂盒所述试剂盒包括前述的探针组和其他试剂。在一些具体的实施方式中，所述其他试剂包括用于扩增T790和C797的引物对，优选地，所述引物对的核苷酸序列如SEQID8～9所示。在一些具体的实施方式中，所述其他试剂包括水、dNTPs、DNA聚合酶、数字PCR反应缓冲液、微滴生成油、阳性参考品本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组，其特征在于，所述探针组由探针1、探针2和探针3组成，其中，所述探针1、探针2和探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、6和7所示，所述探针1、探针2和探针3的两端分别标记淬灭染料和荧光染料，所述探针1标记荧光染料1，所述探针2和探针3均标记荧光染料2。

【技术特征摘要】
1.用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组，其特征在于，所述探针组由探针1、探针2和探针3组成，其中，所述探针1、探针2和探针3的核苷酸序列如SEQIDNO：3、6和7所示，所述探针1、探针2和探针3的两端分别标记淬灭染料和荧光染料，所述探针1标记荧光染料1，所述探针2和探针3均标记荧光染料2。2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述荧光染料1为VIC，所述荧光染料2为FAM。3.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述探针组为单试剂、双试剂或三试剂；可选地，所述探针组为双试剂，包括试剂1和试剂2，其中，试剂1包括探针1，试剂2包括探针2和探针3。4.用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的探针组和其他试剂。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述其他试剂包括用于扩增T790和C797的引物对，优选地，所述引物对的核苷酸序列如SEQID8～9所示。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述其他试剂包括水、dNTPs、DNA聚合酶、数字PCR反应缓冲液、微滴生成油、阳性参考品、阴性参考品和标准品中的一种或多种；优选地，所述dNTPs、DNA聚合酶和数字PCR反应缓冲液为Mix。7.用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的数字PCR反应体系，其特征在于，所述PCR反应体系包括：待测样本、dNTPs、DNA聚合酶、数字PCR反应缓冲液和权利要求1～3任一项所述的探针组。8.用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的系统，其特征在于，所述系统包括数据获取模块和数据分析模块；其中，所述数据获取模块用于获取权利要求7所述PCR反应体系的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄霖霆，曹乾升，俞莹，李杜衡，任用，
申请(专利权)人：江苏先声医学诊断有限公司，南京先声医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32