一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法技术

一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法。本发明专利技术属于分子生物学核酸检测领域，涉及一种利用扩增子测序的方法检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法，所述试剂盒中含有用于检测人类1号染色体1p36.32区域的14组引物对和1q25.2区域的6组引物对、用于检测人类19号染色体19p13.2区域的14组引物对和19q13.33区域的7组引物对的混合物以及用于区分样本的20种标签引物，以及GC稳定剂、PCR酶混合物、纯化磁珠、质控标准品、ddH2O。经过两次PCR扩增及两次产物纯化并测序后，通过READS(1p)/READS(1q)与READS(19q)/READS(19p)的比值来分析样本中1p19q杂合性缺失状态。采用本发明专利技术所述的方法可全面真实准确地反应1p19q的变异情况并且可以同时高通量检测分析96个样本的基因变异，极大地降低了检测成本。

A Kit and Method for Detecting Chromosome Heterozygosity Loss Based on Amplifier Sequencing

A kit and method for detecting chromosome heterozygosity deletion based on amplifier sequencing is presented. The invention belongs to the field of molecular biological nucleic acid detection, and relates to a kit and method for detecting chromosome heterozygosity deletion by amplifier sequencing. The kit contains 14 sets of primer pairs for detecting human chromosome 1 p36.32 region and 6 sets of primer pairs for detecting human chromosome 1 q25.2 region, 14 sets of primer pairs for detecting human chromosome 19 p13.2 region and 7 sets of 19q13.33 region. Mixtures of group primer pairs and 20 label primers used to distinguish samples, as well as GC stabilizers, mixtures of PCR enzymes, purified magnetic beads, quality control standards, ddH_2O. After two PCR amplification and two product purification and sequencing, the loss of 1p19q heterozygosity was analyzed by the ratio of READS (1p)/READS (1q) to READS (19q)/READS (19p). The method described in the invention can reflect the variation of 1p19q comprehensively, truly and accurately, and can simultaneously detect and analyze the gene variation of 96 samples with high throughput, thus greatly reducing the detection cost.

【技术实现步骤摘要】
一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学核酸检测领域，涉及一种基于扩增子测序的方法检测染色体杂合性缺失的试剂盒及方法。
技术介绍
脑胶质瘤起源于神经胶质细胞，是颅内最常见的原发性肿瘤，约占所有中枢神经系统肿瘤的27％，约占恶性肿瘤的80％。我国胶质瘤年发病率为(3～6.4)/10万，年死亡人数达3万。恶性胶质瘤(Glioblastoma，GBM，WHOIV级)的发病率为5.8/10万，5年病死率在全身肿瘤中仅次于胰腺癌和肺癌，位列第3位。少突胶质细胞瘤占胶质瘤5～18％，是胶质瘤的一种独立类型。大多数少突胶质细胞肿瘤均存在1号染色体短臂(1p)和19号染色体长臂(19q)的杂合性缺失(LossofHeterozygosity，LOH)，是指染色体(1；19)(q10；p10)的不平衡易位。具有1p19q联合缺失的胶质瘤对烷化剂化疗和放疗联合烷化剂化疗比较敏感，使患者预后较好。目前，常用于检测lp19q杂合性缺失(LOH)的方法包括：荧光原位杂交(FISH)、和以PCR为基础的杂合性缺失检测(PCR-LOH)。FISH是目前临床上检测LOH的金标准，但检测周期较长，需要有丰富经验的专业人员操作。PCR-LOH检测是一项比较成熟的分子生物学技术，通过有无扩增片断的出现判断是否存在某种缺失。这两种方法检测样本的通量太低，且结果分析掺杂因素较多，不能便捷、准确的判定测试结果。现有技术文件1(申请公布号CN107435077A)公开了使用普通PCR扩增电泳检测法对1号染色体短臂(1p)上的D1S468、D1S436、D1S489基因位点和19号染色体长臂(19q)上的D19S112、D19S217、D19S902基因位点进行检测，并只通过观测扩增条带的亮度来判读lp19q杂合性缺失。现有技术2(申请公布号CN103805707A)公开了使用多重PCR结合毛细管电泳技术对1号染色体短臂(1p)上的D1S468、D1S436、D1S489基因位点和19号染色体长臂(19q)上的D19S112、D19S217、D19S902基因位点进行检测，并只通过毛细管电泳来检测不同基因位点的扩增情况。然而，现有技术文件1和2所公开的基因位点在不同细胞内的染色体上并不是全部缺失，而是部分细胞发生LOH，也就是说上述所检测的基因位点并不能判定染色体是否发生完全缺失的状态，而是反映了基因表达量高低的变化。这些现有技术文件的任一个都没有公开和暗示将扩增子测序并通过测序结果对染色体上的每一个待检测区段的覆盖度(RAEDS数量)进行统计并基于RAEDS(长臂)/RAEDS(短臂)或RAEDS(短臂)/RAEDS(长臂)的比值以确定染色体杂合性缺失的准确状态的想法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供：用于测定人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因表达的引物对；用于测定人类1号染色体长臂1q25.2区域7个基因表达的引物对；用于测定人类19号染色体短臂19p13.2区域15个基因表达的引物对；用于测定人类19号染色体长臂19q13.33区域8个基因表达的引物对；用于标记不同样本的标签引物；高通量检测染色体杂合性缺失的试剂盒；该试剂盒的使用方法；该试剂盒的用途。本专利技术人通过深入广泛的研究，得到了本专利技术所述的由SEQIDNO：1～SEQIDNO108条引物并与GC稳定剂、PCR酶混合物、纯化磁珠、ddH2O一起组成检测染色体1p19q杂合性缺失的试剂盒。本专利技术人已惊奇地发现使用该试剂盒既可以显著增强染色体杂合性缺失的检测准确性，又可以显著增加样本的检测数量、降低检测成本，从而完成本专利技术。本专利技术的第一方面，提供了用于测定人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因表达的引物对，所述引物对由SEQIDNO：1和SEQIDNO：22、SEQIDNO：2和SEQIDNO：23、SEQIDNO：3和SEQIDNO：24、SEQIDNO：4和SEQIDNO：25、SEQIDNO：5和SEQIDNO：26、SEQIDNO：6和SEQIDNO：27、SEQIDNO：7和SEQIDNO：28、SEQIDNO：8和SEQIDNO：29、SEQIDNO：9和SEQIDNO：30、SEQIDNO：10和SEQIDNO：31、SEQIDNO：11和SEQIDNO：32、SEQIDNO：12和SEQIDNO：33、SEQIDNO：13和SEQIDNO：34、SEQIDNO：14和SEQIDNO：35所示序列的引物组成。本专利技术的第二方面，提供了用于测定人类1号染色体长臂1q25.2区域7个基因表达的引物对，所述引物对由SEQIDNO：15和SEQIDNO：36、SEQIDNO：16和SEQIDNO：37、SEQIDNO：17和SEQIDNO：38、SEQIDNO：18和SEQIDNO：39、SEQIDNO：19和SEQIDNO：40、SEQIDNO：20和SEQIDNO：41、SEQIDNO：21和SEQIDNO：42所示序列的引物组成。本专利技术的第三方面，提供了用于测定人类19号染色体短臂19p13.2区域15个基因表达的引物对组，所述引物对由SEQIDNO：43和SEQIDNO：66、SEQIDNO：44和SEQIDNO：67、SEQIDNO：45和SEQIDNO：68、SEQIDNO：46和SEQIDNO：69、SEQIDNO：47和SEQIDNO：70、SEQIDNO：48和SEQIDNO：71、SEQIDNO：49和SEQIDNO：72、SEQIDNO：50和SEQIDNO：73、SEQIDNO：51和SEQIDNO：74、SEQIDNO：52和SEQIDNO：75、SEQIDNO：53和SEQIDNO：76、SEQIDNO：54和SEQIDNO：77、SEQIDNO：55和SEQIDNO：78、SEQIDNO：56和SEQIDNO：79、SEQIDNO：57和SEQIDNO：80所示序列的引物组成。本专利技术的第四方面，提供了用于测定人类19号染色体长臂19q13.33区域8个基因表达的引物对，所述引物对由SEQIDNO：58和SEQIDNO：81、SEQIDNO：59和SEQIDNO：82、SEQIDNO：60和SEQIDNO：83、SEQIDNO：61和SEQIDNO：84、SEQIDNO：62和SEQIDNO：85、SEQIDNO：63和SEQIDNO：86、SEQIDNO：64和SEQIDNO：87、SEQIDNO：65至SEQIDNO：88所示序列的引物组成。本专利技术的第五方面，提供了用于标记不同样本的标签引物对，所述引物对由SEQIDNO：89～SEQIDNO：96和SEQIDNO：97～SEQIDNO：108所示序列的引物随机组成。本专利技术的第六方面，提供了用于标记不同样本的标签引物对，所述引物SEQIDNO：89～SEQIDNO：96和SEQIDNO：97～SEQIDNO：108具有1～96种组合并且每个组合可以标记一个样本，从而可以同时分析96个样本。本专利技术的第七方面，提供了一种基于扩增子测序检测染色体杂合性缺失的试剂盒，它含有SEQIDNO：1～SEQIDNO：88所示序列组成的44对引物对混合物、20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于测定人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因表达的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：35所示序列的引物组成。

【技术特征摘要】
1.用于测定人类1号染色体短臂1p36.32区域14个基因表达的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQIDNO：1和SEQIDNO：22、SEQIDNO：2和SEQIDNO：23、SEQIDNO：3和SEQIDNO：24、SEQIDNO：4和SEQIDNO：25、SEQIDNO：5和SEQIDNO：26、SEQIDNO：6和SEQIDNO：27、SEQIDNO：7和SEQIDNO：28、SEQIDNO：8和SEQIDNO：29、SEQIDNO：9和SEQIDNO：30、SEQIDNO：10和SEQIDNO：31、SEQIDNO：11和SEQIDNO：32、SEQIDNO：12和SEQIDNO：33、SEQIDNO：13和SEQIDNO：34、SEQIDNO：14和SEQIDNO：35所示序列的引物组成。2.用于测定人类1号染色体长臂1q25.2区域7个基因表达的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQIDNO：15和SEQIDNO：36、SEQIDNO：16和SEQIDNO：37、SEQIDNO：17和SEQIDNO：38、SEQIDNO：18和SEQIDNO：39、SEQIDNO：19和SEQIDNO：40、SEQIDNO：20和SEQIDNO：41、SEQIDNO：21和SEQIDNO：42所示序列的引物组成。3.用于测定人类19号染色体短臂19p13.2区域15个基因表达的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQIDNO：43和SEQIDNO：66、SEQIDNO：44和SEQIDNO：67、SEQIDNO：45和SEQIDNO：68、SEQIDNO：46和SEQIDNO：69、SEQIDNO：47和SEQIDNO：70、SEQIDNO：48和SEQIDNO：71、SEQIDNO：49和SEQIDNO：72、SEQIDNO：50和SEQIDNO：73、SEQIDNO：51和SEQIDNO：74、SEQIDNO：52和SEQIDNO：75、SEQIDNO：53和SEQIDNO：76、SEQIDNO：54和SEQIDNO：77、SEQIDNO：55和SEQIDNO：78、SEQIDNO：56和SEQIDNO：79、SEQIDNO：57和SEQIDNO：80所示序列的引物组成。4.用于测定人类19号染色体长臂19q13.33区域8个基因表达的引物对，其特征在于：所述引物对由SEQIDNO：58和SEQIDNO：81、SEQIDNO：59和SEQIDNO：82、SEQIDNO：60和SEQIDNO：83、SEQIDNO：61和SEQIDNO：84、SEQIDNO：62和SEQIDNO：85、SEQIDNO：63和SEQIDNO：86、SEQIDNO：64和SEQIDNO：87、SEQIDNO：65至SEQIDNO：88所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建，冯晓燕，林挺，于祥春，穆珑丹，
申请(专利权)人：艾普拜生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32