一种重组人铁蛋白分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：发酵后的大肠杆菌菌液离心后获得菌泥，菌泥溶解于缓冲液后进行加热、离心或过滤处理，得滤液；利用阴离子层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含目的蛋白的洗脱缓冲液；利用阳离子层析对步骤2)得到含目的蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集含目的蛋白的洗脱缓冲液；利用疏水层析对步骤3)得到的含目的铁蛋白的洗脱缓冲液进行三次分离，收集含目的蛋白的洗脱缓冲液。本发明专利技术具有操作简便，目的蛋白回收率高，纯度高等优点。

A Method for Isolation and Purification of Recombinant Human Ferritin

The invention discloses a method for separating and purifying recombinant human ferritin, which comprises the following steps: obtaining bacterial sludge after centrifugation of fermented Escherichia coli liquid, heating, centrifuging or filtering the bacterial sludge after dissolving in buffer solution, separating the filtrate obtained in step 1 by anion chromatography, collecting the elution buffer containing the target protein; In step 2, the elution buffer containing the target protein was separated twice to collect the elution buffer containing the target protein. In step 3, the elution buffer containing the target protein was separated three times by hydrophobic chromatography to collect the elution buffer containing the target protein. The invention has the advantages of simple operation, high recovery rate of target protein and high purity.

【技术实现步骤摘要】
一种重组人铁蛋白分离纯化方法
本专利技术涉及蛋白质分离纯化的
，特别是一种重组人铁蛋白分离纯化方法的

技术介绍
铁蛋白(Ferritin)广泛存在于各种生物体内，由24个亚基自发组成，笼状蛋白复合体结构，是一种天然的高分子生物材料。其在生物体内具有储存铁元素、抗氧化等功能，但作为一种天然的高分子材料，也可做为纳米载体广泛用于药物输送、医学成像等，同时铁蛋白可以与在肿瘤细胞内高效表达的转铁蛋白受体结合用于肿瘤的诊断与治疗。铁蛋白可用转基因技术在大肠杆菌内得到高效表达，然后进行菌体细胞破碎实现蛋白的分离纯化。传统的铁蛋白分离纯化方法大多采用沉淀法，包括乙醇沉淀、利凡诺沉淀和硫酸铵沉淀，但采用沉淀法制得的铁蛋白相对纯度和回收率都较低，后逐渐采用层析法取代沉淀法，通过离子交换层析和疏水层析等层析方式对铁蛋白进行分离纯化。但现有的一些层析法存在回收率低，每步层析都需要进行脱盐稀释操作较为繁琐不利于大规模生产，铁蛋白的纯度还不能达到医疗用品的级别。
技术实现思路
本专利技术的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种重组人铁蛋白分离纯化方法，能够使铁蛋白分离纯化方法操作简便可适合大规模生产，蛋白回收率高，纯度高。为实现上述目的，本专利技术提出了一种重组人铁蛋白分离纯化方法，包括以下步骤：1)发酵后的大肠杆菌菌液离心后获得菌泥，菌泥溶解于缓冲液后进行加热、离心或过滤处理，得滤液；2)利用阴离子层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；3)利用阳离子层析对步骤2)得到含铁蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；4)利用疏水层析对步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液进行三次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液。作为优选，所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5-100mMPB或TrispH7.0，所述步骤1)中加热的温度范围和时间分别为70-75℃、5-15min，所述步骤1)中过滤处理采用0.22um中空纤维或滤膜过滤处理方式。作为优选，所述步骤2)具体为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用0.5MNaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5MNaOH清洗结合能力比较强的杂质，用10mMNaOH保存层析柱。作为优选，所述步骤2)中阴离子层析介质为QBestaroseHighPerformance、QSepharoseHighPerformance、DEAEBestaroseHighPerformance、DEAESepharoseHighPerformance、SOURCEQ、QBestaroseFastFlow、QSepharoseFastFlow、DEAEBestaroseFastFlow、DEAESepharoseFastFlow、QBestaroseBigBeads、QsepharoseBigBeads、QBestaroseBigBeads、QsepharoseBigBeads、DiamondQ、CaptoQ、DiamondQmustang、CaptoQmustang、CaptoDEAE、DiamondDEAE或DiamondDEAEmustang中的一种；所述步骤2)中结合缓冲液为5-100mMPB或TrispH7.0；所述步骤2)中清洗缓冲液为5-100mMPB或MESpH6.0或5-100mMPB或Tris0.1MNaClpH7.0中的一种；所述步骤2)中洗脱缓冲液为5-100mMNaACpH4.5或5-100mMPB0.25MNaClpH7.0；所述步骤2)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。作为优选，所述步骤3)具体为；取装有阳离子层析介质的层析柱，用0.5MNaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5MNaOH清洗结合能力比较强的杂质，用10mMNaOH保存层析柱。作为优选，所述步骤3)中阳离子层析介质为SPBestaroseHighPerformance、SPSepharoseHighPerformance、DiamondMMC、CaptoMMC、DiamondMMCmustang、CaptoMMCimpres、SPBestaroseFastFlow、SPSepharoseFastFlow、CaptoSPimpres、DiamondSPmustang、CMBestaroseFastFlow或CMSepharoseFastFlow中的一种；所述步骤3)中结合缓冲液为5-100mMNaAcpH5.0或5-100mMNaAc0.2MNaClpH5.0；所述步骤3)中洗脱缓冲液为5-100mMPB0.01MNaClpH6.0或5-100mMPBpH6.0；所述步骤3)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。作为优选，所述步骤4)具体为；取装有疏水层析介质的层析柱，用0.5MNaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用纯水洗脱杂质，用0.5MNaOH清洗层析柱，用10mMNaOH保存层析柱。作为优选，所述步骤4)中疏水层析介质为ButylBestaroseHighPerformance、ButylSepharoseHighPerformance、DiamondButylmustang、CaptoButylimpres、ButylBestaroseFastFlow、PhenylSepharoseFastFlowHS、PhenylSepharoseFastFlowLS、PhenylBestaroseFastFlowHS、PhenylBestaroseFastFlowLS、ButylSepharoseFastFlow、Diamondbutyl、Captobutyl、CaptoPhenylHS、CaptoPhenylimpres、DiamondPhenylmustang或DiamondPhenyl中的一种；所述步骤4)中结合缓冲液为5-100mMPB或Tris0.8-2MNa2SO4pH7.0、5-100mMPB或Tris1.5-3MNaClpH7.0、5-100mMPB或Tris0.8-2.5M(NH4)2SO4pH7.0或5-100mMPB或Tris0.8-2MK2HPO4pH7.0中的一种；所述步骤4)中洗脱缓冲液为5-100mMPB或Tris0.2-0.5MNa2SO4pH7.0、5-100mMPB或Tris0.8-1.2MNaClpH7.0、5-100mMPB或Tris0.4-0.8M(NH4)2SO4pH7.0、5-100mMPB或Tris0.4-0.8MK2HPO4pH7.0中的一种；所述步骤4)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。作为优选，所述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)均需进行蛋白指标检测。作为优选，所述蛋白指标指标检测采用凝胶过滤检测和离子色谱检测方式。本专利技术的有益效果：本专利技术采用阴离子层析、阳离子层析和疏水本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：1)发酵后的大肠杆菌菌液离心后获得菌泥，菌泥溶解于缓冲液后进行加热、离心或过滤处理，得滤液；2)利用阴离子层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；3)利用阳离子层析对步骤2)得到含铁蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；4)利用疏水层析对步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液进行三次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液。

【技术特征摘要】
1.一种重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：1)发酵后的大肠杆菌菌液离心后获得菌泥，菌泥溶解于缓冲液后进行加热、离心或过滤处理，得滤液；2)利用阴离子层析对步骤1)得到的滤液进行分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；3)利用阳离子层析对步骤2)得到含铁蛋白的洗脱缓冲液进行二次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液；4)利用疏水层析对步骤3)得到的含铁蛋白的洗脱缓冲液进行三次分离，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液。2.如权利要求1所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤1)中溶解菌泥的缓冲液为5-100mMPB或TrispH7.0，所述步骤1)中加热的温度范围和时间分别为70-75℃、5-15min，所述步骤1)中过滤处理采用0.22um中空纤维或滤膜过滤处理方式。3.如权利要求1所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2)具体为：取装有阴离子层析介质的层析柱，用0.5MNaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，再用清洗缓冲液清洗杂质，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5MNaOH清洗结合能力比较强的杂质，用10mMNaOH保存层析柱。4.如权利要求3所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤2)中阴离子层析介质为QBestaroseHighPerformance、QSepharoseHighPerformance、DEAEBestaroseHighPerformance、DEAESepharoseHighPerformance、SOURCEQ、QBestaroseFastFlow、QSepharoseFastFlow、DEAEBestaroseFastFlow、DEAESepharoseFastFlow、QBestaroseBigBeads、QsepharoseBigBeads、QBestaroseBigBeads、QsepharoseBigBeads、DiamondQ、CaptoQ、DiamondQmustang、CaptoQmustang、CaptoDEAE、DiamondDEAE或DiamondDEAEmustang中的一种；所述步骤2)中结合缓冲液为5-100mMPB或TrispH7.0；所述步骤2)中清洗缓冲液为5-100mMPB或MESpH6.0或5-100mMPB或Tris0.1MNaClpH7.0中的一种；所述步骤2)中洗脱缓冲液为5-100mMNaACpH4.5或5-100mMPB0.25MNaClpH7.0；所述步骤2)中结合缓冲液平衡层析柱至流出液的PH和电导均与结合缓冲液的PH和电导保持一致。5.如权利要求1所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤3)具体为；取装有阳离子层析介质的层析柱，用0.5MNaOH处理层析柱，之后用结合缓冲液平衡层析柱后上样，洗脱缓冲液进行洗脱，收集含铁蛋白的洗脱缓冲液，用0.5MNaOH清洗结合能力比较强的杂质，用10mMNaOH保存层析柱。6.如权利要求5所述的重组人铁蛋白分离纯化方法，其特征在于：所述步骤3)中阳离子层析介质为SPBestaroseHighPerformance、SPSepharoseHi...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔晴晴，张洪，时鑫，倪春杰，
申请(专利权)人：平湖优谱生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33