用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物及其应用。本发明专利技术主要是将该DNA微型条形码引物用于中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的鉴别过程，该过程主要包括DNA微型条形码引物的设计，甲片基因组DNA的提取，DNA微型条形码基因片段的扩增与测序，对测序结果在NCBI中进行BLAST比对，同时构建基于DNA微型条形码的NJ系统树。本发明专利技术提供的鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物扩增效率高，特异性强，质量好，测序成功率高，能够准确鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片。

DNA miniature bar code primers for identification of processed nails of Pangolin chinensis and Horseshoe nails of domestic pigs

The present invention belongs to the field of molecular biology, and specifically relates to DNA mini*bar code primers used to identify the processed armor slices of Pangolin chinensis and Horseshoe Armor and their applications. The present invention mainly applies the DNA minibar code primer to the identification process of the processed nail slices of Pangolin Chinese and Pig's shoe armor. The process mainly includes the design of DNA minibar code primers, the extraction of DNA from the nail slices, the amplification and sequencing of DNA minibar code gene fragments, the BLAST comparison of sequencing results in NCBI, and the construction of NJ*system tree based on DNA minibar code. \u3002 The DNA miniature bar code primer provided by the invention for identifying the processed nail slices of Pangolin chinensis and Pig's shoe nail*has high amplification efficiency, strong specificity, good quality and high success rate of sequencing, and can accurately identify the processed nail slices of Pangolin chinensis and Pig's shoe nail*

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物方法领域本专利技术属于分子生物学领域，具体而言，本专利技术涉及用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物。
技术介绍
穿山甲片为鲮鲤科动物穿山甲(Manispentadactyla)的鳞甲，是一种名贵的动物药材，可用于经闭癓瘕、乳汁不通、痈肿疮毒、风湿痹痛、中风瘫痪、麻木拘挛。其中中华穿山甲是我国药典规定的中药穿山甲甲片的唯一正品来源。然而，穿山甲这一古老的哺乳动物，因遭到大肆非法捕猎陷入了濒临灭绝的地步，已被列入我国药用濒危野生动物之一。因中华穿山甲资源极其稀少，而且存量甲片价格昂贵，一些不法商贩往往用家猪蹄甲(Susscrofadomestica)炮制甲片来冒充中华穿山甲炮制甲片。这两种甲片在炮制后的形态、色泽、气味等方面都较为相似，难以通过常规手段区分，从而影响了药材质量及用药安全，给药材市场监管带来了困扰。DNA条形码技术是通过对生物基因组内一段标准DNA片段进行分析比较来实现物种识别的一种分子鉴定技术，其在动物分类与鉴定中的发展与应用最为迅速与广泛，研究也较为系统和深入。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(cytochromeoxidasesubunitI，COI)在绝大多数动物物种中具有序列特异性，该序列以每百万年2％的进化速率不断演化，提供了足够的可识别变异信号位点，其中长度约为650bp的片段可作为动物物种鉴定的标准条形码序列。作为物种鉴定分类的一种新方法，DNA条形码技术有着独特的优势，但也存在一定的局限性。例如，对于经过高温炮制的样本，由于DNA发生降解，采用标准条形码引物很可能无法扩增出标准长度的COI基因片段，也就无法鉴定样本的物种。然而，采用微型条形码技术可以解决这一难题。DNA微型条形码是指长度一般约为200bp的DNA序列，与DNA标准条形码(一般超过500bp)相比，DNA微型条形码更容易从DNA降解样本中扩增获得。中国专利申请CN108103217A公开了一种快速鉴别食腺嘌呤节孢酵母菌株的DNA条形码引物、DNA条形码、试剂盒、方法和应用，该方法包括提取全基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，对扩增结果进行纯化，测序，将测序结果进行拼接，比对等，该方法可以快速鉴别普洱茶发酵菌株食腺嘌呤节孢酵母TMCC70007，但是，该方法共涉及四条DNA条形码引物，这在一定程度上增加了试验操作的难度，而且扩增后还需要将四段序列进行拼接，操作过程复杂，也增加了鉴别过程中出错的概率，而且，该方法只适用于鉴别真菌。因此，现有技术中利用DNA标准条形码鉴别炮制样品时普遍存在DNA降解问题，而且鉴别过程中操作复杂，出错概率提高，因此应用范围窄，成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中存在的缺点，提供一种中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码鉴别方法，该方法主要针对难以获得全长DNA序列的炮制类动物中药材，操作过程简单，不易出错，能够扩大DNA条形码技术的应用范围。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，其特征在于，包括特异性的COI-L191引物对和特异性的COI-L197引物对，其中，特异性COI-L191引物对包括COI-L191-F上游引物和COI-L191-R下游引物，所述COI-L197引物对包括COI-L197-F上游引物和COI-L197-R下游引物，上述引物的核苷酸序列分别为：COI-L191-F上游引物：5'-AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG-3'，COI-L191-R下游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'；COI-L197-F上游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'，COI-L197-R下游引物：5'-AGTAGTCAGAAACTTATGTT-3'。一种鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，包括以下步骤：S1、基于中华穿山甲和家猪的COI基因，设计特异性微型引物，得特异性COI-L191引物对，COI-L197引物对；S2、提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA，测定DNA的浓度与纯度，得高质量的全基因组DNA；S3、以步骤S2所得高质量的全基因组DNA为模板，利用步骤S1所得特异性COI-L191引物对或COI-L197引物对，进行PCR扩增，得COI基因片段；S4、将步骤S3所得COI基因片段利用琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行双向测序，将测序结果利用Blast和NJ系统树比对，即可。进一步地，所述步骤S1所得特异性COI-L191引物对包括COI-L191-F上游引物和COI-L191-R下游引物，所述COI-L197引物对包括COI-L197-F上游引物和COI-L197-R下游引物，上述引物的核苷酸序列分别为：COI-L191-F上游引物：5'-AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG-3'，COI-L191-R下游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'；COI-L197-F上游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'，COI-L197-R下游引物：5'-AGTAGTCAGAAACTTATGTT-3'。进一步地，所述步骤S2中提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的具体操作为：(1)取30-100mg炮制甲片样品，用体积分数为75％的乙醇水溶液除去表面杂质，剪碎后加入炮制甲片样品体积6倍的裂解缓冲液，得裂解液样品；(2)向步骤(1)所得裂解液样品中加入10-30mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，于50℃-60℃条件下放置2-4h，得混合液I；(3)向步骤(2)所得混合液I中加入200μL体积分数为0.5％-1.0％的十二烷基硫酸钠水溶液，混匀，于50℃-75℃条件下放置30-60min，加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀10-30s，得带絮状沉淀的混合液；(4)将步骤(3)所得带絮状沉淀的混合液加入硅胶膜吸附柱中，离心20-40s后弃掉废液，向吸附柱中加入500μL缓冲液，离心20-40s，弃掉废液，向吸附柱中加入600μL体积分数为70％的乙醇水溶液，离心20-40s后弃掉废液，再次离心1-4min后弃掉废液，静置1-5min，得絮状沉淀；(5)向步骤(4)所得絮状沉淀中加入50-200μL10-200mMTris-HCl缓冲液，室温放置1-5min后离心1-4min，即得。进一步地，所述步骤(1)中的裂解缓冲液由10-200mMTris-HCl和25-100mMEDTA组成。进一步地，所述步骤(4)，步骤(5)中的离心条件为10000rpm-14000rpm。进一步地，所述步骤S2中测定DNA浓度是采用紫外分光光度计或酶标仪检测DNA溶液在260nm处的吸光值；所述测定DNA纯度是采用紫外分光光度计或酶标仪检测DNA溶液在260nm和280nm处的吸光值。进一步地，所述步骤S3中进行PCR扩增时，PCR反应具体条件如下：共配制50μL的PCR体系，其中PCRmix预混液为35-45μL，上下游引物各1-3μL，DNA模板2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，其特征在于，包括特异性的COI‑L 191引物对和特异性的COI‑L 197引物对，其中，特异性COI‑L 191引物对包括COI‑L191‑F上游引物和COI‑L191‑R下游引物，所述COI‑L 197引物对包括COI‑L197‑F上游引物和COI‑L197‑R下游引物，上述引物的核苷酸序列分别为：COI‑L191‑F上游引物：5'‑AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG‑3'，COI‑L191‑R下游引物：5'‑AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA‑3'；COI‑L197‑F上游引物：5'‑AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA‑3'，COI‑L197‑R下游引物：5'‑AGTAGTCAGAAACTTATGTT‑3'。

【技术特征摘要】
1.用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物，其特征在于，包括特异性的COI-L191引物对和特异性的COI-L197引物对，其中，特异性COI-L191引物对包括COI-L191-F上游引物和COI-L191-R下游引物，所述COI-L197引物对包括COI-L197-F上游引物和COI-L197-R下游引物，上述引物的核苷酸序列分别为：COI-L191-F上游引物：5'-AAAAAGGTTGTRTTYAGGTTGCG-3'，COI-L191-R下游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'；COI-L197-F上游引物：5'-AAATTAATAGCCCCTAGRATTGA-3'，COI-L197-R下游引物：5'-AGTAGTCAGAAACTTATGTT-3'。2.一种如权利要求1所述的用于鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于，包括以下步骤：S1、基于中华穿山甲和家猪的COI基因，设计特异性微型引物，得特异性COI-L191引物对，COI-L197引物对；S2、提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA，测定DNA的浓度与纯度，得高质量的全基因组DNA；S3、以步骤S2所得高质量的全基因组DNA为模板，利用步骤S1所得特异性COI-L191引物对或COI-L197引物对，进行PCR扩增，得COI基因片段；S4、将步骤S3所得COI基因片段利用琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行双向测序，将测序结果利用Blast和NJ系统树比对，即可。3.如权利要求2所述的DNA微型条形码引物在鉴别中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片中的应用，其特征在于：所述步骤S2中提取中华穿山甲和家猪蹄甲炮制甲片样品DNA的具体操作为：(1)取30-100mg炮制甲片样品，用体积分数为75％的乙醇水溶液除去表面杂质，剪碎后加入炮制甲片样品体积6倍的裂解缓冲液，得裂解液样品；(2)向步骤(1)所得裂解液样品中加入10-30mg/mL蛋白酶K溶液，混匀，于50℃-60℃条件下放置2-4h，得混合液I；(3)向步骤(2)所得混合液I中加入200μL体积分数为0.5％-1.0％的十二烷基硫酸钠水溶液，混匀，于...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，李海峰，陈宏，孙敬，张瑾，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：北京,11