一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法，试剂盒包括：含有混合引物的PCR反应液I，含有分型探针的PCR反应液Ⅱ，Taq/UNG酶混合液，含有P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照，阴性对照；混合引物包括：用于扩增P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域的引物序列，用于扩增HBB基因的引物序列；分型探针包括：用于分型鉴定P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列，用于鉴定HBB基因的探针序列；本发明专利技术的设计可以对样本中的疟原虫进行检测并对四种疟原虫进行准确分型；本发明专利技术采用疟原虫线粒体cox3基因为目标基因进行检测，从而具有更高的特异性和灵敏。

A Kit for Detecting Plasmodium Nucleic Acid Typing and Its Application

The invention discloses a Plasmodium nucleic acid typing detection kit and its application method. The kit includes: a PCR reaction solution I containing mixed primers, a PCR reaction solution I I containing typing probes, a Taq/UNG enzyme mixture, a positive control and a negative control o f recombinant plasmids containing specific region sequences o f P.v, P.f, P.o and P.m mitochondrial cox3 gene; and a mixed primer includes: a positive control and a negative control for amplifying P.v, P.m mitochondrial cox3 gene. The primer sequence o f specific region o f mitochondrial cox3 gene o f f, P.o, P.m. is used to amplify the primer sequence o f HBB gene. The typing probes include: the specific region sequence o f mitochondrial cox3 gene o f P.v, P.f, P.o, P.m. is used to identify the probe sequence o f HBB gene; the design o f the present invention can detect the malaria parasite in the sample and accurately typing the four malaria parasites; The cox3 gene of Plasmodium was used as the target gene for detection, so it has higher specificity and sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法
本专利技术涉及疾病检测辅助领域，特别是一种疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
疟疾，热带和亚热带地区广泛传播的传染性疾病，由寄生原生生物疟原虫的感染引起。可以感染人的四种疟原虫，含恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae)、卵形疟原虫(Plasmodiumovale)及间日疟原虫(Plasmodiumvivax)。此外，疟疾对国家和个人的财富具有负面影响。非洲每年因疟疾需花费高达上百亿美元，且每年至使其国内生产总值出现减缓。疟疾会导致生产力损失，使得社会陷入更深的贫困和对投资和旅游业造成负面影响。此外，由于疟疾对于五岁龄以下儿童的高死亡率，对社会结构也造成了较大的影响。在许多疟疾流行的国家，快速和准确地诊断疟疾成为一项挑战。据世界卫生组织统计，每年有超过两亿确诊的疟疾病例，导致近一百万例死亡。在疟原虫属的四个种中，恶性疟原虫引起的疟疾危险度最高，死亡率最高，因此必须迅速鉴定且从其他对人类致病的疟原虫种中将其区分出来。另外，大多数疟疾流行区典型的感染涉及两种或多种上述疟原虫的混合感染；这些混合感染经常难以被检测到或被低估。混合感染检测的失败会导致治疗不全面，以及可能会导致更为严重的疾病。因此，急需开发一种在疟疾流行区简便、快速、高灵敏度和种特异性的疟疾诊断方法。目前疟疾诊断的金标准是血涂片的显微镜检。如果疟原虫密度很高，这种显微镜检具有相对较高的灵敏度和特异性并且能够确定疾病发展的阶段和感染种属。然而，当疟原虫密度较低的时，该方法则比较繁琐，需要训练良好的专家，并且可能导致治疗上的延误。在一些无法开展标准实验室诊断的地区，为提高疟疾诊断的速度和精确性，研究者们开发了基于免疫反应的疟疾快速诊断试验。然而，该类产品的灵敏度有较大波动，并且只有针对恶性疟原虫的种特异性的产品。且当寄生虫密度较低、在混合感染期间、在药物治疗之后或在感染慢性期过程中的情形下需要较长的观察时间和通过显微镜检来验证诊断。因此，这种状况可导致假阴性结果或不可靠的诊断。此外，还有针对的疟原虫18SrDNA的巢式PCR检测，由于疟原虫基因组的富含AT，使得该检测方法所需引物设计较为复杂，特异性较低且该方法需进行两轮扩增反应，操作较为繁琐。总之，上述常用的疟疾诊断方法，存在检测的情况有限、操作比较繁琐、需要训练良好的专家或无法检测出疟原虫种属差异等问题；市场需要一种特异性强、灵敏度高的疟原虫核酸分型检测试剂盒，本专利技术解决这样的问题。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的疟原虫核酸分型检测试剂盒及其使用方法，本专利技术的设计可以对样本中的疟原虫进行检测并对P.v、P.f、P.o、P.m四种疟原虫进行准确分型；本专利技术以疟原虫线粒体cox3基因为目标基因进行检测，相较于18SrRNA拷贝数更多，且cox3基因为线粒体基因，其免疫压力更小、突变率更低，从而本专利技术具有更高的特异性和灵敏度。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，包括：含有混合引物的PCR反应液I，含有分型探针的PCR反应液Ⅱ，Taq/UNG酶混合液，含有P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照，阴性对照；混合引物包括：用于扩增P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域的引物序列，用于扩增HBB基因的引物序列；分型探针包括：用于分型鉴定P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列，用于鉴定HBB基因的探针序列。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，PCR反应液I包括：水；10×PCRbuffer；1-25mMMg离子；1-25mMdNTPs；1-100μMP.vcox3基因上游引物VF：SEQ.ID.NO:1，CCTTACGTACTCTAGCTTTTA；1-100μMP.vcox3基因下游引物VR：SEQ.ID.NO:2，GAGTTCTTTTTCTATTCAGAATAA；1-50μMP.vcox3基因探针VP：SEQ.ID.NO:9，CAATATTATTGTCTATACTAGATACTATAGTT；1-100μMP.fcox3基因上游引物FF：SEQ.ID.NO:3，CCTTACGTACTCTAGCTATGA；1-100μMP.fcox3基因下游引物FR：SEQ.ID.NO:4，GAGTTCTTATTCTATTCAGAATAA；1-50μMP.fcox3基因探针FP：SEQ.ID.NO:10，CAATTGTCTATTCGTACAATTATTCATATATATATTT；1-50μM人HBB基因上游引物IF：SEQ.ID.NO:13，GAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGT；1-50μM人HBB基因下游引物IR：SEQ.ID.NO:14，CAGCTCACTCAGTGTGGCAAAG；1-25μM人HBB基因探针IP：SEQ.ID.NO:15，ATGGCCTGGCTCACCTGGACAACC。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，探针的末端使用荧光基团标记；P.vcox3基因探针VP的末端采用荧光集团标记，标记物为：FAM-BHQ1；MP.fcox3基因探针FP的末端采用荧光集团标记，标记物为：JOE-BHQ2；人HBB基因探针IP的末端采用荧光集团标记，标记物为：ROX-BHQ2。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，PCR反应液Ⅱ包括：水；10×PCRbuffer；1-25mMMg离子；1-25mMdNTPs；1-100μMP.ocox3基因上游引物OF：SEQ.ID.NO:5，CCTTACGTACTCTAGCTATTT；1-100μMP.ocox3基因下游引物OR：SEQ.ID.NO:6，GAGTTCTTATTCTATTCTGAATAA；1-50μMP.ocox3基因探针OP：SEQ.ID.NO:11，CAAACATAATATCGTCAAATATAAGTACTTTATTC；1-100μMP.mcox3基因上游引物MF：SEQ.ID.NO:7，CCTTACGTACTCTAGCTTTGT；1-100μMP.mcox3基因下游引物MR：SEQ.ID.NO:8，GAGTTCCTATTCTATTCAGAATAA；1-50μMP.mcox3基因探针MP：SEQ.ID.NO:12，CAAATTAATTCGTCTACATTAGATACTATATTT；1-50μM人HBB基因上游引物IF：SEQ.ID.NO:13，GAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGT；1-50μM人HBB基因下游引物IR：SEQ.ID.NO:14，CAGCTCACTCAGTGTGGCAAAG；1-25μM人HBB基因探针IP：SEQ.ID.NO:15，ATGGCCTGGCTCACCTGGACAACC。前述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，P.ocox3基因探针OP的末端采用荧光集团标记，标记物为：FAM-BHQ1；MP.mcox3基因探针MP的末端采用荧光集团标记，标记物为：JOE-BHQ2；人HBB基因探针IP的末端采用荧光集团标记，标记物为：ROX-BHQ2。前述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，其特征在于，包括：含有混合引物的PCR反应液I，含有分型探针的PCR反应液Ⅱ，Taq/UNG酶混合液，含有P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照，阴性对照；所述混合引物包括：用于扩增P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域的引物序列，用于扩增HBB基因的引物序列；所述分型探针包括：用于分型鉴定P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列，用于鉴定HBB基因的探针序列。

【技术特征摘要】
1.一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，其特征在于，包括：含有混合引物的PCR反应液I，含有分型探针的PCR反应液Ⅱ，Taq/UNG酶混合液，含有P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列的重组质粒的阳性对照，阴性对照；所述混合引物包括：用于扩增P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域的引物序列，用于扩增HBB基因的引物序列；所述分型探针包括：用于分型鉴定P.v、P.f、P.o、P.m线粒体cox3基因特定区域序列，用于鉴定HBB基因的探针序列。2.根据权利要求1所述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，其特征在于，PCR反应液I包括：水；10×PCRbuffer；1-25mMMg离子；1-25mMdNTPs；1-100μMP.vcox3基因上游引物VF：SEQ.ID.NO:1，CCTTACGTACTCTAGCTTTTA；1-100μMP.vcox3基因下游引物VR：SEQ.ID.NO:2，GAGTTCTTTTTCTATTCAGAATAA；1-50μMP.vcox3基因探针VP：SEQ.ID.NO:9，CAATATTATTGTCTATACTAGATACTATAGTT；1-100μMP.fcox3基因上游引物FF：SEQ.ID.NO:3，CCTTACGTACTCTAGCTATGA；1-100μMP.fcox3基因下游引物FR：SEQ.ID.NO:4，GAGTTCTTATTCTATTCAGAATAA；1-50μMP.fcox3基因探针FP：SEQ.ID.NO:10，CAATTGTCTATTCGTACAATTATTCATATATATATTT；1-50μM人HBB基因上游引物IF：SEQ.ID.NO:13，GAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGT；1-50μM人HBB基因下游引物IR：SEQ.ID.NO:14，CAGCTCACTCAGTGTGGCAAAG；1-25μM人HBB基因探针IP：SEQ.ID.NO:15，ATGGCCTGGCTCACCTGGACAACC。3.根据权利要求2所述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，其特征在于，探针的末端使用荧光基团标记；所述P.vcox3基因探针VP的末端采用荧光集团标记，标记物为：FAM-BHQ1；所述MP.fcox3基因探针FP的末端采用荧光集团标记，标记物为：JOE-BHQ2；所述人HBB基因探针IP的末端采用荧光集团标记，标记物为：ROX-BHQ2。4.根据权利要求1所述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，其特征在于，PCR反应液Ⅱ包括：水；10×PCRbuffer；1-25mMMg离子；1-25mMdNTPs；1-100μMP.ocox3基因上游引物OF：SEQ.ID.NO:5，CCTTACGTACTCTAGCTATTT；1-100μMP.ocox3基因下游引物OR：SEQ.ID.NO:6，GAGTTCTTATTCTATTCTGAATAA；1-50μMP.ocox3基因探针OP：SEQ.ID.NO:11，CAAACATAATATCGTCAAATATAAGTACTTTATTC；1-100μMP.mcox3基因上游引物MF：SEQ.ID.NO:7，CCTTACGTACTCTAGCTTTGT；1-100μMP.mcox3基因下游引物MR：SEQ.ID.NO:8，GAGTTCCTATTCTATTCAGAATAA；1-50μMP.mcox3基因探针MP：SEQ.ID.NO:12，CAAATTAATTCGTCTACATTAGATACTATATTT；1-50μM人HBB基因上游引物IF：SEQ.ID.NO:13，GAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGT；1-50μM人HBB基因下游引物IR：SEQ.ID.NO:14，CAGCTCACTCAGTGTGGCAAAG；1-25μM人HBB基因探针IP：SEQ.ID.NO:15，ATGGCCTGGCTCACCTGGACAACC。5.根据权利要求4所述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，其特征在于，探针的末端使用荧光基团标记；所述P.ocox3基因探针OP的末端采用荧光集团标记，标记物为：FAM-BHQ1；所述MP.mcox3基因探针MP的末端采用荧光集团标记，标记物为：JOE-BHQ2；所述人HBB基因探针IP的末端采用荧光集团标记，标记物为：ROX-BHQ2。6.根据权利要求1所述的一种疟原虫核酸分型检测试剂盒，其特征在于，所述Taq/UNG酶混合液包括：热启动DNA聚合酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄希文，杨芳梅，查帮玲，徐红梅，
申请(专利权)人：合肥欧创基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34