家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种家族性高胆固醇血症基因检测用的试剂盒，该试剂盒包括同时检测LDLR基因SEQ 1中第207位变异位点、LDLR基因SEQ 2中第357位变异位点、PCSK9基因SEQ 3中第255位变异位点、LDLRAP1基因SEQ 4中第558位变异位点和APOB基因SEQ 5中第398位变异位点的特异性引物及二代测序检测的常规组件等。本发明专利技术的试剂盒通过二代测序技术同时检测分析LDLR基因、PCSK9基因、LDLRAP1基因和APOB基因上的变异位点，可快速、低成本的在临床上辅助诊断FH患者。

Gene Detection Kit for Familial Hypercholesterolemia

The invention discloses a kit for gene detection of familial hypercholesterolemia. The kit includes specific primers for simultaneous detection of 207 mutation site in LDLR gene SEQ 1, 357 mutation site in LDLR gene SEQ 2, 255 mutation site in PCSK9 gene SEQ 3, 558 mutation site in LDLRAP1 gene SEQ 4 and 398 mutation site in APOB gene SEQ 5, and Conventional components of second generation sequencing detection, etc. The kit can simultaneously detect and analyze the mutation sites of LDLR gene, PCSK9 gene, LDLRAP1 gene and APOB gene by the second generation sequencing technology, and can rapidly and cheaply assist in the clinical diagnosis of FH patients.

【技术实现步骤摘要】
家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒
本专利技术涉及医学和生物技术，具体涉及一种家族性高胆固醇血症基因检测用的试剂盒，该试剂盒可基于二代测序技术同时检测LDLR基因、PCSK9基因、LDLRAP1基因和APOB基因的变异位点，从而在临床上辅助诊断患该疾病的个体。
技术介绍
家族性高胆固醇血症(Familialhypercholesterolemia，FH)是一种以血浆低密度脂蛋白胆固醇浓度显著升高为特征的遗传性疾病，其它临床特征表现为总胆固醇(TC)水平显著升高、脂类在皮肤肌腱和动脉处堆积，引起早发性动脉粥样硬化，增加心血管疾病的发生风险，严重者青少年时期可发生冠心病甚至心梗死亡。家族性高胆固醇血症主要分二种类型：杂合子FH，属于这一类者，子女从父母一方中遗传FH基因；纯合子FH，属于这一类者，子女从父母双方遗传FH基因。在西方国家，普通人群中杂合子FH的患病率在1/200-1/600，有奠基者效应的地区(例如南非、加拿大的魁北克和黎巴嫩等)除外。以往报道的纯合子FH患病率大概是1/100万，目前的患病率可能是之前预测的3倍左右。因此，据估计世界范围内有将近3600万的FH患者，在中国则有将近380万FH患者。而目前的数据显示，在大多数国家，FH都没有得到充分的诊断和治疗，尤其是在国内，FH没有得到广泛的重视。由于缺乏足够的重视和有效的检测方法，我国FH患者的诊断率较低，目前国内FH的发病率还是未知的。2016年国际动脉粥样硬化学会(IAS)专家组对严重家族性高胆固醇血症(FH)发布的共识声明指出，高胆固醇血症是动脉粥样硬化心血管疾病的一个独立因素。另外，FH的严重程度与开始治疗的年龄也有关系，晚期治疗的患者具有更高的动脉粥样硬化性心血管疾病风险。英国一项对3382例FH患者长达26年的随访结果提示，管理欠佳的FH患者常有更高的死亡率和心血管事件再发率。基于以上数据，FH患者早期诊断和积极干预十分重要，而基因检测可以帮助FH的早期诊断。因此，开发适用于家族性高胆固醇血症的高通量基因检测试剂盒，将有助于尽早诊断FH患者并对其进行管理和干预治疗，解决临床上一类脂质代谢疾病的辅助诊断难题。目前，FH的基因检测主要通过一代测序方法，该方法相对比较成熟、全面、读长较长、准确性高，判读结果相对简单；但是它也有不可避免的缺点，如操作相对繁琐不能自动化，测序成本高、通量低，能够检测的突变类型比较单一，对于多位点、大样本病例筛查还是难以完成的。
技术实现思路
本专利技术提供一种应用二代测序法的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，可以解决现有技术中的上述缺陷。本专利技术的技术方案如下：一种家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，该试剂盒包括：检测LDLR基因SEQ1中第207位变异位点、LDLR基因SEQ2中第357位变异位点、PCSK9基因SEQ3中第255位变异位点、LDLRAP1基因SEQ4中第558位变异位点和APOB基因SEQ5中第398位变异位点的特异性引物对。所述特异性引物对可以为引物混合液。所述的特异性引物对是指针对SEQ1中第207位变异位点、SEQ2中第357位变异位点、SEQ3中第255位变异位点、SEQ4中第558位变异位点、SEQ5中第398位变异位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ1中第207位变异位点的DNA片段、包含SEQ2中第357位变异位点的DNA片段、包含SEQ3中第255位变异位点的DNA片段、包含SEQ4中第558位变异位点的DNA片段、包含SEQ5中第398位变异位点的DNA片段的引物对。优选地，所述试剂盒中包含具有SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示序列的引物对、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示序列的引物对、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示序列的引物对、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13所示序列的引物对、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15所示序列的引物对、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示序列的引物对、SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示序列的引物对、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21所示序列的引物对、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23所示序列的引物对、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25所示序列的引物对、SEQIDNO:26和SEQIDNO:27所示序列的引物对、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29所示序列的引物对、SEQIDNO:30和SEQIDNO:31所示序列的引物对、SEQIDNO:32和SEQIDNO:33所示序列的引物对、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35所示序列的引物对、SEQIDNO:36和SEQIDNO:37所示序列的引物对、SEQIDNO:38和SEQIDNO:39所示序列的引物对、SEQIDNO:40和SEQIDNO:41所示序列的引物对、SEQIDNO:42和SEQIDNO:43所示序列的引物对。本专利技术的特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本专利技术的引物不限于上述的19对引物。本专利技术的试剂盒还包括引物混合液、多重PCR混合液、消化缓冲液、消化酶混合液、终止缓冲液、第2轮PCR混合液、TEBuffer、纯化磁珠。上述各常规成分可直接购买得到。本专利技术试剂盒的每一人份还包括：2μL引物混合液；2μL多重PCR混合液；2μL消化缓冲液；2μL消化酶混合液；2μL终止缓冲液；8μL第2轮PCR混合液；30μLTEBuffer；95μL纯化磁珠。本专利技术的试剂盒中包含的试剂所适用的样品份数可以为一人份、二人份、四人份、八人份、更多人份等等，本专利技术不对此进行限定，本领域技术人员可根据需求自行选择和设置。本专利技术的试剂盒的保存温度为-20℃。一种上述任一的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒的使用方法，包含以下步骤：(1)从待检测生物样品中提取基因组DNA样本；(2)以步骤(1)中的基因组DNA样本为模板特异性扩增目的片段，构建测序文库，测序文库质量检测，测序文库进行测序，获得测序结果，检测出所述变异位点。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术首次提供了一种基于二代测序方法检测家族性高胆固醇血症相关基因的试剂盒，该试剂盒可同时检测多个基因、多个突变位点，测序通量和效率大大提高，成本相对降低，检测性价比高；(2)本专利技术通过检测受试者是否携带LDLR基因、PCSK9基因、LDLRAP1基因以及APOB基因的致病突变，可以早期筛查受试者是否携带家族性高胆固醇血症基因突变，为分子诊断提供依据，根据突变类型同时结合临床诊断结果，给予受试者不同的干预治疗；(3)本专利技术的基因检测试剂盒基于多重PCR技术进行测序文库构建，单管可进行多个片段的扩增。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明图1是一例高血脂样本LDLR基因SEQ1中第207位(c.G986A)变异位点的一代测序验证峰图，与本专利技术实施例的试剂盒检测出来的结果一致；图2是另一例高血脂样本LDLR基因SEQ2中第357位(c.C1747T)变异位点的一代测序验证峰图，与本专利技术实施例的试剂盒检测出来的结果一致；图3是又一例高血脂样本LDLRAP1基因SEQ4中第558位(c本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：检测LDLR基因SEQ 1中第207位变异位点、LDLR基因SEQ 2中第357位变异位点、PCSK9基因SEQ 3中第255位变异位点、LDLRAP1基因SEQ 4中第558位变异位点和APOB基因SEQ 5中第398位变异位点的特异性引物对。

【技术特征摘要】
1.一种家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：检测LDLR基因SEQ1中第207位变异位点、LDLR基因SEQ2中第357位变异位点、PCSK9基因SEQ3中第255位变异位点、LDLRAP1基因SEQ4中第558位变异位点和APOB基因SEQ5中第398位变异位点的特异性引物对。2.如权利要求1所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物对是针对SEQ1中第207位变异位点、SEQ2中第357位变异位点、SEQ3中第255位变异位点、SEQ4中第558位变异位点、SEQ5中第398位变异位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ1中第207位变异位点的DNA片段、包含SEQ2中第357位变异位点的DNA片段、包含SEQ3中第255位变异位点的DNA片段、包含SEQ4中第558位变异位点的DNA片段、包含SEQ5中第398位变异位点的DNA片段的引物对。3.如权利要求1或2所述的家族性高胆固醇血症基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含具有SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示序列的引物对、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9所示序列的引物对、SEQIDNO:10和SEQIDNO:11所示序列的引物对、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13所示序列的引物对、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15所示序列的引物对、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17所示序列的引物对、SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示序列的引物对、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21所示序列的引物对、SEQIDNO:22和SEQIDNO:23所示序列的引物对、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25所示序列的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽娟，罗俊，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，上海复星长征医学科学有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31